酿酒酵母细胞壁多糖合成途径改造及菌株特性分析

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1、硕士学位论文酿酒酵母细胞壁多糖合成途径改造及菌株特性分析作者姓名黄聪学科专业发酵工程指导教师韩双艳教授所在学院生物科学与工程论文提交日期2018年4月25日IModificationofpolysaccharidesynthesispathwayofSaccharomycescerevisiaeanditscharacteristicanalysisADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：HuangCongSupervisor：Prof.HanShuangyanSouth

2、ChinaUniversityofTechnologyGuangzhou,ChinaII分类号：Q786学校代号：10561学号：201520133760华南理工大学硕士学位论文酿酒酵母细胞壁多糖合成途径改造及菌株特性分析作者姓名：黄聪指导教师姓名、职称：韩双艳教授申请学位级别：学术型硕士学科专业名称：发酵工程研究方向：酶工程论文提交日期：2018年4月25日论文答辩日期：2018年6月1日学位授予单位：华南理工大学学位授予日期：年月日答辩委员会成员：主席：林影委员：林炜铁李爽崔堂兵梁书利IIIIV摘要天然活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、

3、抗氧化和免疫调节等生物活性，可广泛应用于医药、保健品和化妆品等行业。具有免疫活性的多糖主要来源于植物、动物及微生物中，其中微生物多糖与其它来源的多糖相比，最大的优势在于不受季节、地域和病虫害的限制。酿酒酵母细胞壁55%~65%为葡聚糖，20%为甘露聚糖，并且其具有清晰明朗的遗传背景，工业应用技术成熟，不产生有毒物质，被美国FDA确认为安全性生物，所以成为活性多糖的理想来源。在实际生产中，通过施加压力（渗透压、营养限制、极端pH等）来调控酿酒酵母细胞壁多糖的合成，不仅需要更高的生产成本及工艺条件，往往还难以实现对整个过程的控制。因此通过

4、酿酒酵母细胞壁多糖合成途径的研究，构建非压力诱导即可自身高产多糖的酵母菌株显得尤为必要。本课题首先探究了细胞壁葡聚糖合成途径中的β-1,3-葡聚糖合成酶Fks1及其调节亚基Rho1对细胞壁多糖合成的影响。本研究从酿酒酵母基因组中PCR扩增出其自身内源的Fks1及Rho1基因片段，构建了pUG6-rDNA-Fks1和pUG6-rDNA-Rho1这两种rDNA位点整合型过表达质粒，将重组质粒电转入酿酒酵母感受态中，结合荧光定量PCR分析，成功构建了Fks1及Rho1基因过量表达菌株BY4743/Fks1和BY4743/Rho1，它们的转录

5、水平分别提高了3.38和2.63倍。另外，从酿酒酵母BY4743基因组中PCR扩增出Fks1活性中心的上下游同源臂，通过融合PCR将其与KanMX抗性形成基因敲除盒，通过电转导入酿酒酵母感受态中，结合Real-timePCR分析，成功构建了Fks1活性中心敲除菌株BY4743/△Fks1，敲除区域几乎没有转录量。以上重组酿酒酵母细胞壁内多糖组分，经离子交换色谱测定分析发现：Fks1及Rho1基因过量表达对细胞壁多糖的含量没有影响，Fks1基因活性中心的敲除，葡萄糖含量下降了25.99%，甘露糖含量提高了18.09%，N-乙酰葡糖胺含量

6、提高了169.72%，细胞壁成分发生显著改变。提示β-1,3-葡聚糖合成酶Fks1缺失对细胞壁多糖成分的影响大于过表达β-1,3-葡聚糖合成酶Fks1，且单一依赖过表达β-1,3-葡聚糖合成酶Fks1实现酿酒酵母葡聚糖过量合成的调控不可行。进一步，本研究测定BY4743/△Fks1的生长曲线和对压力环境的耐受性，发现Fks1敲除后菌株表现出生长延滞及对压力的敏感性，呈现于野生型不同的表型。因而使用RNA-Seq转录组技术测定BY4743/△Fks1的转录谱，与对照菌BY4743相比，BY4743/△Fks1有1151个表达差异基因，其

7、中662个基因为显著上调基因，489个基因为显著下调基因。通过GO功能富集分析和KEGGPathway富集分析，发现其碳代谢及MAPKV途径具有显著差异。甘露聚糖合成途径中，甘露聚糖前体合成、链延长修饰及O-端甘露聚糖合成的过程增强；葡聚糖合成途径中，UDP-葡萄糖合成β-1,3-葡聚糖过程中的过程增强，UDP-葡萄糖转为糖原、海藻糖和甘露糖等的过程减弱。MAPK途径中负责响应酵母细胞细胞壁完整性压力的CWI信号途径激活，同时响应细胞应对高渗、信息素和饥饿的途径弱化。最后，研究基于上述获得的BY4743/△Fks1中CWI信号途径激活

8、的调控方式，考虑从激活BY4743的CWI信号途径着手，调控细胞壁葡聚糖的含量。从酿酒酵母基因组中PCR扩增出其自身内源的Msb1（涉及β-1,3-葡聚糖合成酶及Pkc1-MAP途径正调控的假设蛋白）、Sph1（MAP激