产对香豆酸及其衍生物的酿酒酵母菌株的构建与优化

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1、产对香豆酸及其衍生物的酿酒酵母菌株的构建与优化TheConstructionandOptimizationofP-coumaricAcidanditsDerivativesProducingSaccharomycescerevisiae工程领域：制药工程作者姓名：张伟指导教师：李炳志教授企业导师：肖文海高工天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究

2、所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月摘要苯丙素类化合物及黄酮类化合物作为均以对香豆酸为出发前体骨架化合物的一大类天然产物，具有广泛的生物活性及药理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎抗菌等，同

3、时也在化妆品及食品工业领域具有广泛应用，其生物合成的研究在合成生物学中占据很大的比重。因此，对此类化合物通过合成生物学进行生物合成的构建及优化具有重要意义。本研究以三个节点化合物作为代表来开展对苯丙素类及黄酮类化合物的生物合成的研究。首先为前体化合物对香豆酸，利用基因工程及代谢工程原理，过表达了酪氨酸反馈抑制相关基因ARO4和ARO7，并利用loxP-Cre系统对旁路相关基因ARO10和PDC5进行敲除，得到对香豆酸的产量为87.56mg/L，是对照菌株的2.05倍，其后有探究了外源添加酪氨酸对产量的影响，确定当酪氨酸的外源添加量为1mM时，对香豆酸产量提高了近一倍。其次，以咖啡酸作为

4、苯丙素类化合物代表，本研究通过探究苯环羟化酶hpaBC不同拷贝数对咖啡酸产量的影响发现，随着拷贝数的增加，咖啡酸的产量也随之提高；此外，本研究通过不同来源的hpaB及hpaC进行组合筛选，对hpaB与hpaC进行适配，同时也对羟化酶与底盘菌株进行适配，通过实验结果可知，不同来源的hpaB与hpaC以及与底盘细胞之间的适配关系不同导致咖啡产量的差异较大，最终筛选出最适配的（也就是咖啡酸产量最高）的为绿脓假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）来源的hpaB和大肠杆菌（Escherichiacoli）来源的hpaC，得到咖啡酸的产量为37.61mg/L。至于黄酮类化合物，本研

5、究选取了平台化合物柚皮素作为研究对象，通过混菌系统对柚皮素的生产进行优化，将导入柚皮素合成路径的酿酒酵母菌株与经过改造的产酪氨酸的大肠杆菌菌株混合培养，并通过对培养基成分的优化以及总接种量和两菌接种比例的优化，最终获得了21.16mg/L的柚皮素产量，8倍于对照菌株。本研究对对香豆酸以及代表化合物咖啡酸及柚皮素的研究，对苯丙素类化合物及黄酮类化合物的生物合成具有借鉴意义。关键词：合成生物学酿酒酵母混菌系统对香豆酸咖啡酸柚皮素IABSTRACTPhenylpropanoidsandflavonoidshavepresentedaplentyofbiologicalactivitiesan

6、dpharmacologicalactivities,suchasantioxidant,anticancer,anti-inflammatory,antibiotic,etc.Moreover,theyalsoplayanimportantroleamongcosmeticsindustryandfoodindustry.Asp-coumaricacidistheprecursorcompoundinthebiosynthesisofphenylpropanoidsandflavonoids,itsbiosynthesisalsoattractmoreattentioninrecen

7、tyears.Threecompoundshadbeenchosentoberepresentativeinthebiosynthesisofphenylpropanoidsandflavonoidsinthisstudy.Firstly,anp-coumaricacidover-producingSaccharomycescerevisiaewasconstructedinourstudy,onthisbasis,L-tyrosinefeed