同源重组技术构建蛋白酶A低表达且能产β葡聚糖酶的酿酒酵母菌株及其性能研究

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1、浙江大学生物系统工程与食品科学学院博士学位论文同源重组技术构建蛋白酶A低表达且能产β-葡聚糖酶的酿酒酵母菌株及其性能研究姓名：张强申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：何国庆20080401浙江人学博士学位论文摘要PEP4／pep4；o'KanMX·bglS。13-l，3一l，4一葡聚糖酶的编码基因在进行替换后得到了有效的表达和分泌，菌株SC．13Gl、SC—BG2培养过程中最高酶活性出现在培养56．64h时，分别为28．1U和20．2U，与用表达载体表达时的出现最高酶活性的时间基本一致。重组菌对数期的生长速度与

2、出发菌株相比略慢，但稳定期的细胞浓度基本一致。而且稳定期以后的生长变化趋势基本一致。考虑到菌株应用的安全性，利用Cre／loxP系统成功的删除了在构建产B．1，3．1，4．葡聚糖酶的酵母菌株SC．BGl时整合在染色体上的KanMX，而且利用实验中使用的包含Cre／loxP系统的质粒pSH—Z的不稳定性，通过传代使质粒丢失而筛选到2株无抗性标记的重组酵母菌株SC一[3G1A、SC一136IB，整合到重组菌株基因组中的bglS基因表达单元没受到影响。对最终获得的无抗性标记的菌株sc-pGlA、sc-pGlB分泌的p一1，

3、3一l，4一葡聚糖酶酶活进行了测定，结果显示删除Karl‘的菌株保留了原来菌株的D，1，3．1，4．葡聚糖酶活性，分别为32．3U和29．1U。对最终获得的重组菌株在实验室进行了继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、凝聚性、热死灭温度等几个重要的生理指标进行了测试，并对发酵液进行了蛋白酶A活性，p一葡聚糖酶活性的测定和研究。结果表明重组I笥株在麦芽汁发酵过程中能够产生较高活性的p．葡聚糖酶。被替换掉一个等位PEP4基因的酿酒酵母菌株的蚩白酶A的活性与出发菌株WZ65相比降低了30—40％。重组菌SC—BGlA、

4、SC-13G!B中bglS表达单元在传代过程中遗传稳定，不发生丢失。与对照菌株相比，重组菌初期生长变缓，但稳定期细胞浓度基本相同，稳定期以后的浓度变化一致；热死灭温度降低2℃；转化菌遗传性能稳定，与对照菌生长性能、发酵力、凝聚性均基本相似。我们选用SaccharomycescerevisiaeSC一13GIA进行了小试，对其啤酒酿造过程中的生长发酵性能以及成品的口味风味特性等方面进行了测试；对该菌株酿制啤酒的多项指标包括浓度、浊度、色度、苦味值、pH、0【-N、总酸、酒精度、发酵度、外观糖度、双乙酰、泡持性、C02、

5、口味、风味等也进行了测试。试验结果表明，重组菌酿制的啤酒酯香味突出、苦味较重，其它与现行干啤相近；各种理化指标均达剑国家标准优级；啤酒泡沫的泡持性从202s增)Jl至U274s。关键词：。1‘：业酿酒酵母菌株；同源重组；13-葡聚糖酶；蛋FI酶A；发酵特性；生理特性VII浙江人学博十学位论文AbstractAbstraetBeta—glucanscouldreducetheextractyieldsinthebrewhouse，affectfiltrationperformanceandparticipateinha

6、zeformationinwortandbeer．Commercial13-glucanasewasaddedintothewortandbeerduringthefermentationtoeliminatetheimpactofIB-glucan．YeastproteinaseA(PrA)，aproteolyticenzymefoundinthevacuoleofSaccharomycescerevisiae，canbeexcretedintobeerunderstressorbyyeastautolysisan

7、disdetrimentaltobeerfoamstability．PrAinhibitorwasusedinbrewhousetoreducethenegativeimpactofPrAonfoamactive—protein．Toresolvetheproblemscausedby13-glucanandPrAinbeerproduction．weconstructedtherecombinantS．cerevisiaestrainwithoneofthePEP4geneWasreplacedbybglSgene

8、fromB．subtilis．Actively13-glucanasesecretingbytherecombinantstrainsWasdetectedandthePrAWaslowerthanthecontrolstrain。ThefermentationpropertyoftherecombinantsWastestandshownea