产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵.pdf

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1、产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵及酶学性质分析姓名：李善军学号：2015304120225院系：华中农业大学生科院摘要蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性,在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K都有着重要的应用。毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的

2、分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析本实验的蛋白酶K属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶K。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K都有着重要的应用。由于林伯氏白色

3、念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶K的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。将蛋白酶K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌及

4、其产物有一个较为深刻的理解。1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵1.1种子液培养1.1.1种子培养基YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%）YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2%1.1.2培养温度与菌龄挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500mLYPG培养基中，30℃，250r/min摇床培养28h。1.2发酵罐培养1.2.1菌体培养清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下表）无机盐培养基，115℃20min灭菌，完成后冷却至30℃。通过补料泵调节pH值为5.0，按4%的接种量接种种子

5、液，并加入头孢1g，PTM1为微量盐87ml（4.35ml/L发酵液），通气搅拌发酵。甘油分批阶段完成时,碳源耗尽，DO急剧上升，时间为24h。此时开始补加50%甘油进入甘油补料阶段，时间为6h。BSM:CaSO4K2SO4MgSO4.7H2OKOH磷酸甘油20L18.6g364g298g82.6g500ml500ml1.2.2甲醇诱导开始进行碳源饥饿0.5h，开始补加甲醇进入甲醇诱导产酶阶段。同时注意温度保持在30度，罐内压0.05MP,转速500r/min,控制甲醇的流速，每6个小时取样，测量菌体生物量。2、酶学性质鉴定2.1酪氨酸标准曲线的制作准确称取干燥的酪氨酸，配置0、20、

6、30、40、40、50、60、70、80ug/ml的酪氨酸溶液。用试管分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4ml的碳酸钠5ml，再加入已稀释的福林试剂1ml，摇匀放入水浴锅中。40度保温发色20min，在分光光度计进行测定（660nm），测3次，取平均值。将各浓度的酪氨酸测得OD值减去0ug/ml的酪氨酸OD值得到净OD值，制作标准曲线如下图1：酪氨酸标准曲线70y=101.34x-0.529660R²=0.99945040g/mLμ30浓度2010000.10.20.30.40.50.60.7吸光度（A660）图12.2确定反应最适ph配制50mmol/LpH6.0、pH7.0

7、、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0、pH12.0、pH13.0的缓冲液。取1mL不同pH稀释合适倍数的粗酶液，加入1mL用相同pH缓冲液配制的底物，混匀，65℃反应10min。以OD660最高的酶活为100%，计算不同pH条件下的相对酶活。2.3确定反应最适温度1)配制合适的ph缓冲液，将粗酶液稀释合适的倍数（根据前面的实验得到最适ph）。2)取稀释好的酶液1mL，加入1mL2%的酪蛋白底物，分别在20℃，30℃，40℃，50