表达纤维素酶的酿酒酵母构建及其发酵纤维素产醇研究

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1、表达纤维素酶的酿酒酵母构建及其发酵纤维素产醇研究ConstructionandevaluationofSaccharomycescerevisiaestrainsexpressingcellulolyticenzymeforethanolproductionfromcellulose学科专业：生物化工研究生：杨华军指导教师：刘成研究员天津大学化工学院二零壹肆年陆月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的

2、材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据中文摘要统合生物加工过程（CBP）简化了纤维素乙醇生产过程、降低了生产成本，被认为是最廉价高效的纤维素乙醇生

3、产工艺。该技术的障碍之一是缺少能直接、有效利用纤维素发酵产醇的微生物菌株，而酿酒酵母是构建此类CBP菌株的最佳出发菌种之一。本研究通过δ-整合方式构建了单独表达一种和共表达多种纤维素酶基因的菌株，考察了相关因素对菌株酶活、生长和产醇的影响，评价了其利用纤维素发酵产醇能力，探讨了其作为CBP菌株的应用潜力。以已有δ-整合棘孢曲霉bgl1的单倍体菌株BGL-a为出发菌株，构建了表达BGL的酿酒酵母1N~4N整倍体系列菌株，进行了酶活、生长以及发酵产醇能力评价，结果表明：(1)二倍体BGL-aα酶活明显比BGL-aa和BGL-αα低，随着倍性增加，菌株BGL酶活增加；(2)菌株生长（OD660）

4、随着倍性增加而降低，但交配型不影响菌株生长（OD660）；(3)倍性、交配型对多倍体系列菌株在10%葡萄糖和10%纤维二糖培养基中发酵产醇的影响均不显著，但是在发酵酸碱预处理玉米芯产醇中受氮源影响很大，二倍体菌株BGL-aα在营养贫瘠和丰富两种条件下均具有最佳的发酵产醇性能。在以尿素为氮源的酸碱预处理玉米芯发酵培养基中，最大乙醇浓度为19.76±1.39g/L，乙醇得率为理论得率的41.92%。。经δ整合平台将6种纤维素酶基因（Trichodermareesei来源的cbh1、cbh2、egl2和Aspergillusaculeatus来源的cbh1、egl1、bgl1）同时整合至菌株W3

5、03-1A染色体上，共整合四次，得到工程菌株LY-1、LY-2、LY-3和LY-4。酸碱预处理玉米芯发酵产醇和酶活结果表明：(1)在外加10FPU/gbiomass和氏璧纤维素酶发酵7天的情况下，LY-3产醇最佳，其的最大乙醇浓度为28.08±1.26g/L，乙醇得率为理论得率的59.57%。而W303-1A在同时添加BGL5FPU/gbiomass情况下的相应值分别为19.54±0.87g/L和41.46%。因此，菌株LY-3在不添加β-葡萄糖苷酶的情况下，纤维素到乙醇的转化率较同时添加5FPU/gbiomassβ-葡萄糖苷酶的的W303-1A提高了18%。(2)从酶活结果看出LY-4与

6、LY-3相比，酶活水平下降，这也与LY-4发酵纤维素料产醇低于LY-3的结果吻合。从产醇和酶活分析得出LY-3性能最优。菌株LY-3与实验室已有菌株W3的进行杂交未能提高LY-3的发酵产醇性能。关键词：酿酒酵母，纤维素酶，倍性，交配型，纤维素乙醇I万方数据ABSTRACTConsolidatedbioprocessing(CBP),whichcouldsimplifytheprocessandreducecostsoffermentationandhydrolysis,wasconsideredasthecheapestandthemostefficientethanolproductio

7、nprocess.OneoftheobstaclesofCBPisthelackofamicroorganismthatcandirectlyandefficientlyutilizecellulosetoproduceethanol.SaccharomycescerevisiaeisoneofthebesthoststrainstoconstructCBPstrains.Strainsexpressingoneormu