酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控.pdf

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1、酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控张根林2015年6月中图分类号：UDC分类号：酿酒酵母中β-香树脂醇合成途径的构建与调控作者姓名张根林学院名称生命学院指导教师李春教授答辩委员会主席邢新会教授申请学位工学博士学科专业生物化工学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年6月Constructionandregulationofβ-amyrinbiosyntheticpathwayinSaccharomycescerevisiaeCandidateName：GenlinZhangSchoolorDepartment:SchoolofLifeScienceFa

2、cultyMentor:Prof.ChunLiChair,ThesisCommittee：Prof.XinghuiXinDegreeApplied:DoctorofEngineeringMajor：BiochemicalEngineeringDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence：June,2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得

3、北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：北京理工大学博士学位论文摘要β-香树脂醇是一种五环三萜化合物，也是其它齐墩果烷型三萜如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架，具有抗炎、抗细菌和真菌、抗病毒及癌细胞防治功效，在降血糖、降血脂方面也具有良好效果。与很多萜类相似，β-香树脂醇在植物中的含量很低，化学合成收率不高，因而限制了其规模化生产和广泛应用。为了提高β-香树脂醇的生产能力，本文利用代谢工程和合成生物学方法在酿酒酵母中构建其合成途径，经途径

4、和发酵过程优化，实现β-香树脂醇的高效合成。研究结果如下：首先将光果甘草β-香树脂醇合酶基因进行密码子优化并采用质粒表达，气相色谱-质谱分析证明在工程酵母SpKb中成功合成了β-香树脂醇，产量为0.75±0.06mg/L，单位细胞产量为0.07±0.02mg/gDCW，为进一步通过途经改造提高β-香树脂醇生产奠定了基础。基于鲨烯处于三萜和甾醇合成途径分支点的特点，以鲨烯库存量为代谢途径平衡点，设计了“推拉式”途径优化措施调控β-香树脂醇合成。首先通过异源表达白色念珠菌鲨烯单加氧酶促进鲨烯向下游2,3-氧化鲨烯的转化，然后过表达大肠杆菌IPP异构酶、酵母自身FPP合

5、酶和鲨烯合酶增强鲨烯供应，这种“推拉式”代谢策略使β-香树脂醇产量达到36.50±1.99mg/L，提高了49倍。依据转录因子UPC2全局调控机理，将UPC2的DNA结合位点序列（SRE序列）重构于构建途径的ADH1p、ALA1p、GPM1p、TYS1p和FBA1p启动子中，启动子强度提高了42.2%~67.5%，强化了β-香树脂醇合成途径的整体表达效率，使其产量进一步提高到48.50±2.55mg/L，在“推拉式”途径优化基础上提高了32.9%。为了下调竞争β-香树脂醇合成的内源甾醇和乙酰辅酶A代谢分流，设计并构建了CRISPR/dCas9系统，对报告基因Lac

6、Z的转录抑制研究发现，gRNA的结构是影响CRISPR/dCas9转录抑制效果的重要因素。进而设计了一步转化、组装多个gRNA进行多基因转录下调的方法，成功将甾醇合成相关的羊毛甾醇合酶基因ERG7和乙酰辅酶A代谢相关的乙醇脱氢酶ADH1/4/5/6、柠檬酸合酶CIT2和苹果酸合酶MLS2基因的7个gRNA实现了一步组装，组装效率达40%，7个基因的转录抑制率平均达75.5%，β-香树脂醇产量比未下调内源竞争代谢的对照菌提高了42.2%，表明CRISPR/dCas9I北京理工大学博士学位论文系统在酵母途径工程优化应用中的潜力。通过对工程菌发酵生产β-香树脂醇的培养条

7、件优化，获得最优的初始pH为5.0、接种OD为0.30、初始葡萄糖浓度为35g/L。采用乙醇补料批式发酵，使β-香树脂醇的产量提高了90.2%。通过梯度补加甲基-β-环糊精，不仅实现了β-香树脂醇向胞外的转运，而且促进了β-香树脂醇的合成，乙醇补料批式发酵方式下β-香树脂醇的产量达到156.7±8.62mg/L，单位细胞产量达18.44±1.91mg/gDCW，分别比初始工程菌SpKb提高了209倍和263倍。关键词：β-香树脂醇；三萜；合成生物学；CRISPR/Cas9；转录调控；酿酒酵母II北京理工大学博士学位论文Abstractβ-amyrin,akindo

8、fpent