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1、高效代谢木糖产乙醇的酵母菌株的选育摘要木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其他化工产品最为重要的一环,但自然界中缺少能将上述生物质有效转化为乙醇的微生物菌种。为提高季也蒙毕赤酵母和休哈塔假丝酵母代谢木糖生产乙醇能力,采用原生质体融合以及化学及物理诱变方法进行育种,得到五个乙醇产量较高的菌株XX2,X1,X4,X12和X13。说明原生质体融合和诱变育种是筛选高效菌种的有效途径。关键词：木糖乙醇原生质体融合诱变育种ABSTRACTEfficientfermentationofxyloseconstitutesamajorpartofsuccessfulbioconversionofligno
2、cellulosicbiomassforethanolandotherimportantchemicalproduction,butthereisnonaturalmicroorganismsuitableforefficientlytransformingtherenewablelignocellulosicmaterials.ToimprovetheEthanolFermentationofXyloseofPichiaguillermondiiandCandidashehatea,weusestheProtoplastFusionandMutagenisistobreedfivebet
3、terstrainsXX2,X1,X4,X12andX13.AndthisshewthatProtoplastFusionandMutagenisisweregoodforfungusbreeding.Keywords:xyloseethanolprotoplastfusionmutagenisisbreeding目录一前言6二本论72.1材料72.1.1菌种72.1.2培养基72.1.3试剂[5]72.2方法[15]82.2.1菌种活化82.2.2原生质体的制备[6]82.2.3原生质体的形成率与再生率测定82.2.4PEG融合技术92.2.5电击融合92.2.6诱变处理方法[8]92.
4、2.7诱变致死率的测定102.3结果与讨论102.3.1原生质体[14]的形成率与再生率102.3.2融合子复筛后乙醇发酵能力102.3.3紫外诱变时间的选择102.3.4诱变菌株的发酵筛选11三结论12一前言发展可再生清洁能源、保护生态环境已成为人类必须面对的两大课题,燃料酒精被公认为最有发展前景的可再生清洁能源之一。汽油中添加10%~15%酒精的复合燃料汽油醇(Gasohol),是良好的无铅汽油,在一些欧美国家已经开始使用这种燃料。2001年4月国家计委决定十五期间将在大中城市逐步推广使用车用乙醇汽油(汽油醇),这一政策的出台必将给燃料酒精的发展带来极大的商机。目前,国内外均以淀粉质和
5、糖蜜为原料生产酒精,底物成本在生产总成本中占有很大的比例,在欧美发达国家为40%左右[1],而在中国这一数值高达60%~70%。因此开发用于燃料酒精生产的廉价原材料是这一能源领域研究的主要方向之一。地球上最丰富的可再生资源木质纤维素,是光合作用产物,充分将其中可利用成分转化为燃料酒精,不仅可以提供清洁能源,而且有利于推动太阳光能的转化利用,同时促进大气中CO2的循环[2],减少由矿物燃料燃烧造成的CO2净排放。木糖是半纤维素的主要组成部分,在植物纤维材料水解液中占30%左右,是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分[3],以木糖[4]为底物转化酒精的研究,是酒精途径工程研究的热点之一。二本论2.
6、1材料2.1.1菌种季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillermondii,以下简称G)和休哈塔假丝酵母(Candidashehatea,以下简称X)。2.1.2培养基普通YPD:蛋白胨20g,葡萄糖20g,酵母膏10g,蒸馏水定容至1L;固体YPD再加20g琼脂。115℃灭菌30min。再生培养基:在普通YPD中添加17%的蔗糖。115℃灭菌30min。复筛培养基:蛋白胨20g,木糖200g,酵母膏10g,琼脂20g,蒸馏水定容至1L,115℃灭菌30min。木糖YPD:用木糖替换普通YPD中的葡萄糖。诱变固体培养基:普通固体YPD培养基中加0.2%的LiCl。亚硝酸钠和盐酸制取,将亚硝
7、酸钠配成0.01-0.1mol/L的浓度,使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。2.1.3试剂[5]磷酸缓冲液:0.2MNaH2PO492mL和0.2MNa2HPO48mL,pH=5.8。高渗缓冲液:100mL磷酸缓冲液中加17g蔗糖。蜗牛酶(Snaillase):购买于北京欣经科生物技术有限公司。用高渗缓冲液配制为1.5%(用0.22μm滤膜过滤除菌)。预处理剂:100mL磷酸缓冲液中加0.1gEDTA和0.1mLβ-巯基
