可降解淀粉的酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用

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1、中山大学硕士学位论文可降解淀粉的酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用姓名：程少菊申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：罗进贤2003.6.7可降解淀粉的酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用硕士研究生：程少菊导师：罗进贤教授专盈：生物纯学与分子生物学摘要嚣羲祷建豹霹酶瓣淀粉豹辫母基毅工程蘩，其寝耋圭要是实验室蘩抹，这些酵母工程菌的酶活及产洒率都很高，但不适于酒精和酿酒行业中应用。本论文的目的是敬爱产蓉株为宿主，构建栽分解淀耪农生产灌精、警产褴麓建好、势能手灏糟帮酿酒行业中应用的酿酒酵母工程菌。，，蓠先，将本实验嶷梅建静含研转座予s序冤、(；-'t18抗健基因和

2、蔼萄糖淀粉酶基因袭达盒的蹩合型质粒YIpl28D．17N转化灏糖生产菌JLl08，获得的工程菌JLl08(Ylpl28D．17N)实现葡萄糖淀粉酶基因的高效袭达，酶活力达剽143+26删mL，在含有20％淀粉鳃壤莠基中培莠，其淀粉承勰搴达到73。45％，产滔率达到9．43％。该菌融制成固定化细胞在广砥省富川鼹酒精厂进行生产，其产酒率、i达到11．23％以上，毙JLl08撼毫1．s％，势哥繁约蘩莓耱淀羚酶70％戳上。声彩／Y为进一疹提高工程菌的淀粉降解水平和更适合于低pH条件下发酵，本论文通过将rDNA弓l入载俸，逶过凌深重维将GAI轰拷炙整合至宿主絷色体，甄提蹇童程，菌分解

3、淀粉的能力。／阁时，通过DNAshuffling技术改造GAI基因以获得酶瓣力更l褒、簸逶磷在2．8南，5之闯躺薪基戳。为藏，克隆了蔽滔酵舔翡rDNA片段，褥建了含rDNA、G418抗性基因和葡萄糖淀粉酶基因表达盒的整合爨质粒YIp4RGAn和YIpl9RGAn，分澍转化生产菌株JLl08、SD和棚，获褥多株工程菡，英中应用可能性比较离的转化予JLl08(YIp4RGAn)、SD(YIp4RGAn)和删(YIpl9RGAn)的酶活力、淀粉水解水平和酒精产率如下；III用SD(YIp4RGAn)进行白酒酿造实验，在不加酶的情况下，以2．5公斤大米为+，酿造并蒸出1．63升白酒

4、，其酒度为43％，共产生酒精0．7升，大米的利用率虹·s％。W本论文运用Southern杂交技术对构建的工程菌的整合和整合拷贝数进行检发现GAI基因均已整合进宿主染色体，拷贝数各不同，而且拷贝数与酶活力、§率不成正相关。i以上研究成果经过进一步改进，有望应用于酒精和白酒生产行业。涉本论文还尝试运用DNAshuffling技术，对黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因的编码部￡行了体外定向进化改造。§词分解淀粉酿酒酵母工程菌葡萄糖淀粉酶酒精生产DNAshufflingConstructionofStarch—degradingandEthanol—producingSaccharomyces

5、cerevisiaeStrainsandTheirApplicationinEthanolandBrewingIndustryName：ShaojuChengSupervisor：ProfessorJinxianLuoMajor：BiochemistryandMolecularbiologyABSTRACTThehostsofstarch—degradingandethanol-producingengineeredyeastconstructedSOfararelaboratorystrains，theyareunsuitabletobeusedinethanolandb

6、rewingindustry，eventheirenzymeactivityandethanolproducingrateareveryhigh．Theaimofthethesisistodevelopstarch—degradingandethanol—producingyeaststrainswhichhavegoodproductionpropertiesandcanbeappliedtotheproductionbyutilizingthestrainsdirectlyfromtheethanolorbrewingfactories．Firstofall，thein

7、tegratedvectorYIpl28D．17Nharboringthe6sequenceofTytransposon，G418resistantgeneandglucoamylase(GADgeneexpressioncassetteconstructedbythislaboratorywastransformedtoethanolproducingstrains，theglucoamylase(GAI)genewasefficientlyexpressedinJLl08(YIpl28D．17N)，[tsenz