油脂基因工程菌的构建

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1、北京化工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：墨垒丝日期："uol峰．b。玉关于论文使用授权的说明学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门

2、或机构送交论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在一年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。作者签名：导师签名：El期：渔!垡：!』!』Et期：．洫业61』学位论文数据集中图分类号Q78学科分类号18017论文编号1001020141128密级学位授予单位代码10010学位授予单位名称北京化工大学作者姓名李红红学号2011201128获学位

3、专业名称化学工程与技术获学位专业代码081713课题来源国家自然科学基金研究方向生物化工论文题目油脂基因工程菌的构建大肠杆菌JMl09(DE3)，脂肪酸，乙酸，乙酰辅酶A，粘红酵母，流式关键词细胞仪论文答辩日期2014／5／25木论文类型基础研究学位论文评阅及答辩委员会情况姓名职称工作单位学科专长指导教师谭天伟教授北京化工大学生物化工评阅人1田平芳教授北京4k_v-大学分子生物学评阅人2刘珞副教授北京化工大学生物工程评阅人．3评阅人4评阅人5答獭蝴冯嵬教授北京化工大学酶催化答辩委员1王芳教授北京化工大学生物工程答辩

4、委员2张栩教授北京化工大学生物能源答辩委员3邓利副教授北京化工大学生物化工答辩委员4秦培勇副教授北京化工大学生物分离答辩委员5注：一．论文类型：1．基础研究2．应用研究3开发研究4．其它二．中图分类号在《中国图书资料分类法》查询。三．学科分类号在中华人民共和国国家标准(GB／T13745．9)《学科分类与代码》中查询。四．论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。摘要油脂基因工程菌的构建石油需求和石油价格的的目益增长刺激众多的工厂来开发化工和生物燃料的替代能源。随着代谢工程与合成生物学的发展，由微生物细胞直接生产

5、燃料的蓝图正在一步步实现，本研究旨在两个宿主菌：粘红酵母与大肠杆菌JMl09中利用基因工程的方法提高菌株的油脂含量。在粘红酵母研究方面：首先进行了菌种鉴定，根据保守序列设计ITS区域引物，PCR扩增得到粘红酵母618bp的DNA序列，经NCBIBlast比对，得到：其亲缘性Rhodotoruladairenensis(粘质红酵母)有97％的相似性。其次筛选出一株尿嘧啶缺陷型菌株，且实验得粘红酵母为Zeocin抗性敏感型，100ug／ml时达到100％致死。借助Zeocin抗性基因以粘红酵母5．8SRNA为同源臂构建

6、三个不同启动子的同源重组表达盒。然后通过设计兼并引物扩增粘红酵母油脂代谢中关键酶基因，结果苹果酸酶(Ⅷ)扩增区域正确，扩增序列含内含子；柠檬酸裂解酶及乙酰辅酶A羧化酶，扩增区域不完全。最后建立了以易错全基因组为诱变方法，结合尼罗红染色流式细胞仪初筛，磷酸香草醛反应复筛，筛选高产油脂菌株的方法。初步筛选出A3、E1其油脂含量相对于原始菌增加21％。在大肠杆菌JMl09(DE3)方面进行的研究：通过修饰其脂肪酸代谢途径来生产脂肪酸。具体从以下几方面开展：一、在乙酰辅酶A的来源I上增强，扩增aceE，aceF(丙酮酸脱氢

7、酶、脱羧酶)使糖酵解途径的丙酮酸更多的产生乙酰辅酶A；并借助ACS基因，将乙酸代谢途径引入，构建乙酰辅酶A平台；二、在乙酰辅酶A走向脂肪酸合成的途径上加强，扩增屈6D(脂酰辅酶A合酶)，平衡乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的流量，使其流向脂肪酸合成途径；三、通过表达本源的去除信号肽的tesA'，解除脂酰．ACP的抑制，同时也可以控制脂肪酸的链长；四、表达脂肪酸代谢途径的调节因子FadR，使整个脂肪酸合成途径高效运作起来；五、敲除p氧化途径前两步的基因：fadD，fadE。解除脂肪酸p氧化途径的降解。最终利用基因过表达与RED

8、同源重组敲除系统成功构建了载体PETDuet-tesA"fabD-ACS-FadR和pACYC-duet-1一aceE-aceF，敲除了fadD和fadE基因，获得了重组细胞E．coliJMl09(，PETDuet-tesA，-fabD-ACS-FadR，pACYC-duet-1一aceE-aceF，z全fadDE)。具体结果如下：l、诱导条件为4mM的IP