利用基因敲除技术构建苯丙氨酸工程菌

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1、沈阳农业大学硕士学位论文利用基因敲除技术构建苯丙氨酸工程菌姓名：程莉申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：程国华2003.6.15沈阳农业大学硕卜学位论文中文摘要L一苯丙氨酸是一种很有价值的必须氨基酸，人和动物不能自己合成，而微生物能够合成。本实验室目前已构建了具一定生产能力的大肠杆菌生产菌株，为进一步提高该菌株的产酸率，本研究利用基因破坏技术，在宿主菌染色体上定点破坏了tyrA和CsrA基因，一方面敲除tyrA基因，打断酪氨酸合成这条竞争支路：另一方面破坏并置换CsrA基因，通过对共同途径的调控，增加苯丙

2、氨酸合成前体物PEP的含量。l，唑塑的敲除也盯cc31884染色体。NA为模板，PCR扩增得到tyrA基因。构建了430bp缺失突变型tyrA基因片段并插入自杀载体pXL275中，通过体内同源重组，用缺失型tyrA基因完全取代了目的大肠杆菌染色体上的完整tyrA基因，获得了酪氨酸营养缺陷型菌株。经PCR及southernblotting鉴定，基因是以双交换形式进筏旌点同源重组交换的，敲除后工程菌株发酵液中无酪氨酸产生。y2，定点破坏与置换csrA基因协别以ATCC31884染色体DNA和质粒pET28a为模板，PCR扩增得

3、到CsrA基因和Kan基因，构建了插入Kan基因的CsrA片段，将其导入含有编码Red重组系统的pKD46质粒的大肠杆菌ATCC31884△tyrA中。通过同源重组，突变型CsrA取代了目的菌株染色体上的CsrA。经抗性筛选和PCR、Sou啪fnblot鉴定，目的菌株是具有Kan抗性的CsrA敲除菌株。矿3，敲除菌与对照菌的产酸比较(将重组质粒pBV220一ar。G一374分摘要别转化构建的tyrA基因突变体和对照菌ATCC31884、CsrA基因突变体和对照菌ATCC3l884AtyrA中，构建发酵工程菌株。经发酵培养基

4、摇瓶发酵48小时，测定发酵上清液中苯丙氯酸含量。结果．{表明，敲除菌株的产酸量均比对照菌有所提高。＼／●关键词：苯丙氨酸生物合成基因敲除Southernblot√＼／＼／《沈⋯农业人学颂刖学位论文L．苯丙氨酸是利，必需氨基酸，人和动物不能}7t行合成，』女能由植物和微生物合成。它订·食品、饲料、医药和化妆品等领域有着广泛的用途，主要用作氨基酸输液和抗癌制剂，同时也是低热量二肽甜味剂天冬甜精的主要原料之一。随着抗癌药物制剂和氮摹酸输液的发展，尤其是二肽甜味剂的快速发展，苯丙氨酸的需求量迅猛增加，构建高产苯丙氨酸菌株成为人们关

5、心的主要问题。一、L一苯丙氨酸的生产制备I。一苯丙氨酸的方法主要有四种：1．水解抽提法此法{j要是从猪血粉、棉籽饼等原料中提取L一苯丙氨酸，但由于天然蛋门质中L一苯丙氨酸的含量较低，目前很少使用该方法。2．化学合成法该方法曾是生产L一苯内氨酸的丰要方法，但足化学合成产物仃L型、D，魁和DI，型消旋体之分，须经物理、化学法拆分／j能得到I。一苯丙氨酸，加上合成j1：艺复杂、成本较高，此法基本卜已被酶法和发酵法所取代。3．酶法酶汪、qi产的最大特点住j一底物车¨酶结合厉能产生选择性{醍^‰的催化反心，其优点足生广丁艺简单，网收

6、简便，收率较高。山J底物羽I酶的价格关系，廊浊的心川受到限制，但足⋯定化技术的建立和厂‘泛应用促进了它的发展。4．微生物发酵法3前言大体分为前体物发酵法和直接发酵法。前体物发酵法是把氨基酸合成代谢途径的中间体作为原料来发酵生产氨基酸，这样可以绕过终产物对合成途径中关键酶的反馈调节作用，但成本较高。直接发酵法则是利用合适的生产菌株，直接由无机碳源、氮源等原料大量生产氨基酸，由于可以利用廉价而且易得的原料，反应又在常温下进行，因而这是生产L．苯丙氨酸的主要方向。二、L一苯丙氨酸的代谢工程在野生菌体内，L．苯丙氨酸等芳香族氨基酸

7、的合成代谢途径存在着强烈的反馈抑制，生产与蓄积L一苯丙氨酸的能力往往很低，不会超过细胞本身对它的需求，因此要使得代谢终产物能过量贮蓄，就必须采用代谢工程方法对它的代谢途径进行人为控制，改变它的代谢调控机制，才能得到产酸率较高的生产菌株。代谢工程(MetabolicEngineering)，亦称途径工程(PathwayEngineering)和代谢设计(MetabolicDesign)，是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用科学(孙丽萍等，

8、2000)。1．L．苯丙氨酸的合成途径生物体内芳香族氨基酸的合成先出来自磷酸戊糖途径的4一磷酸赤藓糖(E4P)和来自糖酵解途径的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)缩合成3一脱氧一n一阿拉伯庚酮糖酸．7一磷酸(DAHP)，然后经过一个七步共同途径到达分支酸，如图1所示：4沈m收啦天学礤士学位论空PEP+E4P与。