l-苯丙氨酸基因工程菌的构建及其发酵条件研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterBuildingofengineeringbacteriastoproduceL—PhenylalanineandoptimizingthefermentationconditionsofthestrainsByKunyangHuangSupervisor：XuelingRenParmaceuticalAnalysisSchoolofPHarmaceutialScienceMay，2012原创

2、性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：瓒叶次．‘．日期．如脏年多月加日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查

3、阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者苡砷央日期：≯肛年∥月阳日L摘要苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)在医学、食品加工及饲养添加剂领域均有广泛应用，目前国内企业的供应量远不能满足市场口益增长的需求量。因此，应用代谢_L程的方法构建L一苯丙氨酸高产菌株，降低

4、生产成本，对减少我国L一苯丙氨酸进口，提高市场竞争力具有重要意义。选取大肠杆菌L一苯丙氨酸合成路径上的关键酶甘油激酶(glpK基因编码)和3一磷酸甘油脱氢酶(glpD基因编码)，PCR克隆glpK与glpD基因后，将它们分别与载体pAF(C)、pZA31连接，得到载体pAF(C)D、pAF(C)KI、p31K；然后分别改变载体pAF(C)KI的启动子序列和基因glpK基因的核糖体结合位点序列(RBS序列)获得载体pAF(L)K与pAF(C)KII。将一个或两个载体转化入EcohMG△中，构建工程蔺厘coh

5、MG／xpAF(C)D、最coJlMG△pAF(C)ZI、Ec0111dG△pAF(L)KI、￡cohMG／xpAF(C)KII、EcohMGAp31K—pAF(C)、点cohMGApAF(C)KII—p31PT，首次实现了基因glpK与pheA和aroF，基因glpD与pheA和aroF，glpK与pheA、aroF、ppsA和tktA的共表达。将构建的工程菌做SDS-PAGE电泳，glpK和glpD基冈在相应工程菌巾均有表达，即在蛋白电泳凝胶上预期位置56．231KD处(glpK)和56．751KD处

6、(glpD)有表达条带。工程荫在250ml的烧瓶中，37℃、240rpm／min条件下，分别以15g／L葡萄糖和10g／L甘油为碳源进行发酵，结果显示，工程菌在以甘油为碳源的培养基中L一苯丙氨酸产量显著高于以葡萄糖为碳源时的产量，菌株EcohMGApAF(C)KII的L-Phe产生能力较强。以10g／L甘油为碳源发酵48h后，工程菌Ecoh'MGApAF(C)KII的L-苯丙氨酸产量达到3．43g／L，是同条件下对照菌株最cohMGApAF(C)产酸量的3．33倍，是空白菌株EcohMGAL-Phe产量的

7、62．36倍，说明glpK基闪的表达达到了增加终产物L-Phe的目的。以EcolzMGApAF(C)KII为研究对象，进一步的发酵条件优化后，结果显示，大肠杆菌最适生长温度37℃条件下，增加发酵时问、增加发酵过程巾的通气量有利于上程菌L-Phe的产出：在37℃、240rpm／min条件下，EcollMG／kpAF(C)KII在500ml摇瓶中发酵48h后L_Phe产量达到了3．94g／L。本研究构建的￡cohMGZXpAF(C)ZII菌株，实现了在我们前期工作基础上摘要L-Phe产量的进一步提高，为后续_

8、L作中L-Phe高产菌株的构建起到一定的启示作用。关键词：L一苯丙氨酸发酵葡萄糖甘油碳源核糖体结合位点ⅡAbstractPhenylalanineiswidelyusedintheproductionofmedicine,foodandfeedaddictives．Butnow,thepracticalyieldofPhenylalaninefromdomesticenterpriseCanneverevermeetthein