基因工程菌发酵

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1、第八章发酵工程在现代生物技术中的应用第一节基因工程菌发酵第一节基因工程菌发酵一、基因工程基本知识基因工程(geneticengineering)的定义基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体(供体)的基因或基因组提取出来．或者人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体(受体)的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。又称重组DNA技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。工程菌的应用1、基因药物例如，红细胞生成素、胰岛素、干扰素、乙肝疫

2、苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。2、其它发酵产品例如酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生素等。基因工程的基本步骤目的基因获得表达载体构建基因的导入鉴定核酸鉴定：PCR;SouthernandNorthernblot.蛋白鉴定：SDS-PAGE;HPLC;Westernblot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核:包涵体,分泌型真核:穿梭质粒文库合成PCR基因组文库cDNA文库细菌：氯化钙；电穿孔;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V载体质粒(plasmi

3、d)粘粒(cosmid)λ噬菌体(λphage)重组子的形成（一）载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制。1、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。2、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。3、有适合的标记（抗药性基因），易于选择。作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：其他条件：分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。有时还要求载

4、体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。质粒*受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，Λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.co

5、li环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征（二）载体DNA与外源基因片段的连接1、黏性末端

6、DNA分子之间的连接2、平末端DNA片断的连接（1）T4DNA连接酶（2）用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基末端转移酶同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。衔接物连接法衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶

7、切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A衔接物连接法双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI优点：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基

8、因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末