8基因工程菌发酵

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1、第八章基因工程菌培养基因工程菌生产的主要产品有二类：非蛋白质，通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。蛋白质，现代基因工程重点一些正在开发或已开始生产的DNA重组技术产品食品氨基酸及饲食品加工酶料添单细胞蛋白加剂农业植物品种改良（包括增加产量，提高蛋白质含量，改进抗逆性能，具有固氮能力等）生物杀虫剂化工用生物物质生产甲烷、甲醇、乙醇、丙酮-丁醇、多元醇、有机酸等及能用于化学品或生物物质（如纤维素）转化所需要的酶源原用生物催化方法生产环氧烷烃、聚羟基丁酸酯（PHB）等料用

2、藻类生产碳水化合物、蛋白质等物质生产黄原胶等粘性物质（以提高油井的采油量）环境高效生物降解或解毒菌种保护美国批准生产的主要生物技术治疗药物通称商品名生产公司用途1988年销售额5美元）（10人胰岛素HumulinEliLilly治疗糖尿病115人生长激素ProtropinGenentechNovo治疗儿童生长150HumareopeEliLilly发育不良α-干扰素IntronASchering-Plougn治疗毛细胞78～80ReferonAHoffmanLa白血病Roche乙型肝炎疫苗Merck防治乙肝低于30组织血纤维蛋ActivaseG

3、enentech治疗心脏病突170白溶酶激活发症剂——TPA抗T-细胞单克OrthocloneOrtho治疗肾移植抗低于15隆抗体OKT-3异一、基因工程菌培养的特点是外源蛋白在宿主细胞内的异源表达，不同于微生物的天然次级代谢药物，因此在调控合成方式上，应该主要受限于质粒或噬菌体的内在性质；是蛋白质产物，不同于种类多样的次级代谢产物；合成途径简单，没有复杂的多酶系统；产物的积累主要在胞内，分泌型也主要积累在细胞周质中；产物在胞内积累通常是以包涵体的形式；分离纯化相对于次级代谢产物而言要简单、一致；产物分离纯化后可能没有活性，需要进

4、一步的复性。基因工程药物是转基因产品，具有潜在的危险，因此对产生菌的管理要求严格，应该避免各种可能的扩散污染，必须在合格的GMP生产车间进行。基因工程药物的GMP是对生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房、设备，原材料采购入库、检验、发料、加工、制品及半成品检验、分包装，成品检定，产品销售、运输，用户意见及使用反应处理等在内的全过程的质量管理。二、基因工程药物制造的一般流程（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；上游阶段（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；下游阶段（7）半成品检定；（8）包装1、上游阶段：

5、首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。其中的（1）、（2）、（3）步骤属于上游阶段，在实验室完成。2、下游阶段：将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数大的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度纯品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（

6、7）、（8）等属于下游阶段。三、宿主-载体系统宿主的选择主要考虑产物的活性表达和宿主的安全性。如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中，列入的认为是安全的菌。一般的原则是根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高、能稳定传代、受体细胞基因型与载体所含的选择标记需匹配。1、原核细胞（1）大肠杆菌：目前采用最多的原核表达体系。（2）枯草芽孢杆菌（3）链霉菌2、真核细胞（1）酵母：酿酒酵母应用广泛。（2）丝状真菌（3）哺乳动物细胞（4）植物细胞四、基因工程菌发酵1、培养过程通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条

7、件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。2、培养方式（1）补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。（2）连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。（3）透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。（4）固定化培养酿酒酵母的高密度培养及人

8、免疫干扰素的表达人α2α型干扰素（IFN-α2α）是国外已大量生产和广泛应用的抗病毒及抗肿瘤多肽药物。它是由165个氨基酸组成的单链多肽，相对分子