最新基因工程菌的发酵课件PPT.ppt

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1、基因工程菌的发酵第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该

2、种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。四、工程菌的应用1，基因药物红细胞生成素胰岛素干优素乙肝疫苗生长激素粒细胞巨噬细胞集落刺激因子2，其它发酵产品酶制剂氨基酸（苏氨酸、色氨酸）抗生素第二节工程菌的培养就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。一、安全问题关于基因工程的社

3、会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模

4、在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。二、工程菌培养的特点工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。工程菌体的原宿主通常是某些

5、培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。三、工程菌的培养工程菌的营养控制质粒稳定性重组质粒拷贝数的控制及表达效率1，底物浓度的控制在基因工程茵培养过程，至少要遵循PI级物理防护的规定，因此必需进行菌体的高密度培养。从生物安全性考虑，培养的基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。2，质粒稳定性（1）质粒不稳定的类型分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中

6、质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。（2）影响质粒稳定的因素与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响宿主对质粒稳定的影响质粒拷贝数重组质粒的表达对质粒稳定性的影响（3）使质粒稳定的措施组建合适载体选择适当宿主施加选择压力抗生素添加法抗生素依赖变异法营养缺陷型法控制基因过量表达控制培养条件（4）质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即假定在分

7、批培养过程中，细胞在对数生长期每次分裂时，其质粒丢失率为P，则Fn为3，表达效率及质粒拷贝数控制在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。第三节工程菌分批培养动力学对于质粒脱落性不稳定，细胞在分裂时丢失质粒的概率为p，则所以对于底物对于产物第四节培养装置与产物的提取

8、工程菌的培养与普通微生物的培养方法类似。在进行以工业化为目的的DNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌时，当然应采用简便易行的培养系统。现在多半使用大肠杆菌为宿主，而在一般的通气搅拌罐中大肠杆菌能生长良好。一、培养罐作为基因重组体的培养装置，与一直沿用的通气搅拌培养罐要有区别，即不仅要防止外部