最新基因工程菌发酵制药工艺教学讲义PPT课件.ppt

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1、基因工程菌发酵制药工艺现代生物技术制药工艺生物技术制药概论基因工程菌发酵制药工艺动物细胞培养制药工艺重组蛋白质药物分离、检测与质量控制基因工程菌发酵培养制药工艺工程菌的种类与特征基因工程技术工程菌的构建工程菌的分子与细胞学基础工程菌发酵的动力学工程菌发酵的工艺与操作技术发酵过程检测与控制技术许多微生物在工业上通过发酵生产药物，由于其遗传背景、基因转录、表达等方面存在一定问题，并不是所有工业用微生物都可作为基因工程宿主菌而使用。宿主菌的生长发育及遗传各有其特点，对营养、环境等生存因素的要求也不尽同。充分了解和深入研究宿主菌的特征，才能合理选择，构建出最佳的工程菌。工程菌发酵制药表达系统G

2、－，单细胞，杆状。裂殖，37℃17分钟繁殖一代。白色至黄白色的菌落，光滑，直径2－3mm。鞭毛，较长。无芽孢，一般无荚膜。一、大肠杆菌表达系统大肠杆菌（Eschericliacoli）形态特征工程菌发酵制药表达系统能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。生化与遗传特性工程菌发酵制药表达系统不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利分离和减少蛋白酶降解，避免N

3、端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。通过对表达载体的改造，通常与分泌蛋白融合表达或与膜透性蛋白共表达，蛋白质分泌到细胞外的培养液中。产物表达形式工程菌发酵制药表达系统发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。大量外源基因能超量的表达，部分药物上市。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强。不用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。优点和不足工程菌发酵制药表达系统G＋，单细胞，芽孢。杆状，无荚膜。裂殖，31分钟繁殖一代。有

4、鞭毛。污白至微黄色的菌落，粗造，不透明，不闪光。二、芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌（Bacillus）形态特征工程菌发酵制药表达系统革兰氏阳性菌（a）与阴性菌(b)细胞区别工程菌发酵制药表达系统好氧发酵，水解淀粉，还原硝酸盐，液化明胶。现在至少10余种芽孢杆菌可作为宿主菌。枯草芽孢杆菌的基因组：4.21Mb，有4100个开放阅读框架。生长与遗传特性工程菌发酵制药表达系统安全：不产生内毒素；大多数对人畜无致病性；分泌功能强大：产物被加工和直接释放胞外，很多商品酶是胞外蛋白；发酵后处理变得简便，直接分离产物，提高产量。存在问题：对目标产物进行降解：蛋白酶分泌量大、种类多。质粒不稳定性：有时在摇瓶

5、阶段就检测不到了。优点与不足工程菌发酵制药表达系统酶类：碱性蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶、青霉素酶、头孢霉素酰化酶等都实现了商业化生产。营养缺陷和抗生素突变株还能进行核苷药物（肌苷、黄苷、尿苷等）、抗生素发酵。真核基因：人生长素、胃蛋白酶抑制剂、IFN、EGF、tPA、乙肝核心抗原等。应用工程菌发酵制药表达系统链霉菌（Streptomyces）重要生产抗生素的工业微生物。放线菌产生的4000多种抗生素中，链霉菌产生的约占90％。链霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、红霉素、螺旋霉素、四环类抗生素等。三、链霉菌表达系统工程菌发酵制药表达系统丝状多核单细胞原核生物，G＋，能形成孢子。固体培养：基内

6、菌丝,气生菌丝。当营养耗竭时，激活孢子形成的条件，气生菌丝成熟并分化成孢子菌丝，断裂形成分生孢子。生长特性工程菌发酵制药表达系统基因组：约8.7Mb，7800个基因；染色体是线性，质粒是线性的。遗传特性工程菌发酵制药表达系统工业化成熟，有适合载体，就可用于大规模生产；绝大多数为非致病菌，不产生内毒素；高密度培养，生长期长，稳定期仍维持合成蛋白质；产物分泌到胞外，分离纯化较容易。前景：通过基因工程技术生产抗生素是人们正追求的目标。可用于次生代谢产物生物合成及其调控基因的表达，通过代谢工程，提高产量或生产新型杂合抗生素。优点与不足工程菌发酵制药表达系统单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形或香

7、肠形。芽殖、裂殖为主。在特定条件下才产生子囊孢子。在固体培养基上，菌落乳白色，有光泽，边沿整齐。四、酵母表达系统形态特征工程菌发酵制药表达系统孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景相当清楚。基因组：120.68Mb，阅读开放开架5887个，编码约6000个基因生长与遗传