最新第5章基因工程菌的发酵课件ppt.ppt

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1、第5章基因工程菌的发酵基因工程菌表达蛋白质的目的：基因工程菌表达蛋白质，有两个目的：目的一：目标产物是蛋白质，故要设法提高发酵液中该蛋白质的含量，提高体积生产速率。目的二：外源基因所表达的产物，是酶等代谢调控的成分。外源基因的表达适度为宜，不宜过分表达。否则要引起宿主细胞代谢的紊乱。本章主要内容5.1基因工程菌的稳定性5.2　影响外源基因表达水平的因素5.3　基因工程菌的高密度发酵5.1.1培养条件对稳定性的影响5.1.1.1培养基的影响5.1.1.2比生长速率的影响5.1.1.3外源基因的表达的影响5.1.1.4其它培养条件的影响5.1.1.1培养基的影响基因工程菌在复

2、合培养基中显示较高的质粒稳定性。在基本培养基中造成基因工程菌比例下降的主要原因是基因工程菌和宿主菌比生长速率的差异。限制性底物种类对质粒稳定性有很大的影响。对于给定的基因工程菌，培养时选用恰当的限制性底物有可能明显提高质粒稳定性，但需要进行实验确认。5.1.1.2比生长速率的影响判断质粒的稳定性的指标：传代数(而不是丢失全部质粒所需时间)；质粒的稳定性与重组菌的比生长速率有关。但不同的基因工程菌质粒稳定性与比生长速率的关系呈现不同的规律。一些基因工程芽孢杆菌在较高的比生长速率下显示较差的质粒稳定性。而未经重组的菌，比生长速率一般快于重组菌。原因：代谢活动较少。故两者的比生

3、长速率有差异(Δμ)。这是连续培养时，重组菌质粒不稳定性下降的主要原因。质粒稳定性也与带质粒细胞丢失质粒的概率(p)有关。在连续培养中，稀释率(D)越大，基因工程菌在培养液中的比例下降加快。因为D增大，同时带动Δμ和p的增大。5.1.1.3外源基因的表达的影响外源基因的高表达会引起重组质粒的不稳定性。5.1.1.4其它培养条件的影响温度：温度升高，基因工程菌的质粒稳定性变差。pH和溶氧：由不同的实验数据看，没有明显的规律可循。应对所用的菌种进行研究，然后决定采用哪种工艺参数，才能保证质粒的稳定性。固定化：菌体经固定化后，质粒的稳定性较好。主要原因可能是经固定化后的菌传代次

4、数较少。尚未形成质粒丢失的个体。操作方式：周期性补料比分批培养的方式的质粒稳定性较好。5.1.2发酵过程中群体组成的变化发酵过程要求纯种发酵。但是对于基因工程菌，绝对的纯种发酵很难保持。细胞和重组细胞两种类型可能同时存在。条件改变，两者的比例会发生变化。研究发酵过程中，重组细胞比例变化的规律，是发酵过程优化的重要内容。Imanaka模型α反映了丢失和带有重组质粒的细胞生长速率的差异。α一般在1-2之间。α小于0，说明基因工程菌失去耐药性而被杀死aS＋X＋→(2－p)X＋＋pX¯•bS＋X¯→2X¯•经时间t的培养后，基因工程菌传代n次。可以推导出基因工程菌在培养液中的比例

5、Fn为：•Fn＝　（1－α－p）/［1－α－p×2n(a＋p－1)］•α＝　μ－/μ＋Imanaka的基因工程菌脱落性不稳定的模型设：质粒丢失的概率为p，基因工程菌和丢失质粒的宿主菌分别以恒定的比生长速率增殖。S为限制性底物浓度，X+为带有重组质粒的菌体浓度，X—为丢失重组质粒的菌体浓度，a和b为系数。μ＋和μ－分别是带有重组质粒和丢失重组质粒菌体的比生长速率，开始培养时菌体浓度分别是X0+和X0—。由于基因工程菌中质粒的复制与维持以及外源基因的表达需要消耗更多的物质和能量，丢失重组质粒的宿主菌更具有生长的优势，故α一般在1-2之间。分批发酵过程基因工程菌质粒丢失的模型

6、dX＋/dt=μm＋S(1－p)X＋/(Ks＋S)dX－/dt=μm－SX－/(Ks＋S)＋μm＋SX＋p/(Ks＋S)丢失本身的生长丢失后转变过来的dS/dt=－dX＋/dtY+－dX－/dtY－dP/dt=αdX＋/dt＋βX＋5.2　影响外源基因表达水平的因素外源基因表达水平的影响因素包括：基因剂量、转录和翻译效率、启动子、中止编码、重组DNA的稳定性、mRNA的稳定性、重组蛋白质的稳定性、宿主细胞和载体的特性、偏爱密码子等因素。此外，外源基因表达水平的影响因素还包括：基因工程菌的培养条件、反应器的操作和过程控制。影响外源基因表达水平的因素5.2.1　培养基5.2.

7、2　比生长速率5.2.3培养条件5.2.4　外源基因表达的诱导强度5.2.5　代谢产物的影响5.2.1　培养基培养基的设计要点，要能满足基因工程菌的高密度培养，均衡的培养基的设计是关键，多由实验确定最优的培养基。5.2.2　比生长速率许多基因工程菌外源蛋白质的生产显示出与生长速率正相关的特点。故保持较高的比生长速率可提高目标蛋白质的产量。对于外源基因需诱导表达的基因工程菌发酵，可分为菌体生长和外源基因诱导表达两个阶段。分别控制合适的生长和表达条件。5.2.3培养条件5.2.3.1　溶氧外源基因的高表达需要细胞合成大量的mRNA