《基因工程菌的发酵》PPT课件

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1、第六节基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性及其对策基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善基因工程菌不稳定性的策略基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的表现基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的

2、生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排基因工程菌的稳定性基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促

3、进重组分子的缺失重排基因工程菌的稳定性重组质粒的逃逸率当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有：高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促使重组质粒渗漏受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧影响基因工程菌稳定性的因素载体的选择遗传特性宿主的选择外源基因整合到宿主染色体上培养基生长速率发酵工艺限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达基

4、因工程菌的稳定性提高基因工程菌稳定性的策略改进载体受体系统以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点禁止DNA片段插在稳定区内将受体细胞的致死性基因安装在载体上同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因）基因工程菌的稳定性培养基一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸

5、和其他物质，微生物的生长较在基本培养基中快。培养条件对基因工程菌稳定性的影响比生长速率基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度，pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和pH下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。培养条件对基因工程菌稳定性的影响限制性基质一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响培养条件对基因工程菌稳定性的影响

6、pH和溶解氧pH和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的pH和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。培养条件对基因工程菌稳定性的影响外源基因的表达外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。例如，吲哚丙烯酸（IAA）是trp操纵子阻遏物的部分去阻遏剂，在培养大肠杆菌MV

7、12（pVH5）时，在培养基中加入不同量的IAA，发现随IAA量的增加，pVH5带有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表达水平有很大提高，同时比生长速率下降，培养液中Trp－的比例上升。电泳分析表明60%～70%色氨酸合成能力丧失是由于质粒结构的变化，其余是由于质粒丢失造成。培养条件对基因工程菌稳定性的影响提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无

8、能为力载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂，成本较高提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分