利用CRISPR_Cas9技术构建Hoxc13基因敲除兔模型

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1、：１０１８３分类号：Ｓ８５２．１单位代码２密级：公开研究生学号：２０１５８５２００吉林大学硕士学位论文学术学位（）＊利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术构建基因敲除兔模型ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨｏｘｃ１３ＧｅｎｅＫｎｏｃｋｏｕｔＲａｂｂｉｔｂｙＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９作者姓名：邓吉超专业：基础兽医学研究方向：组织学与胚胎学指导教师：赖良学教授培养单位：吉林大学２０１８年１２月未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位

2、和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限。）。否则，应承担侵权的法律责任吉林大学博士（或硕士）学位论文原创性声明：所呈交学位论文本人郑重声明，是本人在指导教师的指导。下，独立进行研究工作所取得的成果除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担

3、学位论文作者签名：１＞日期：年月《日利用CRISPR/Cas9技术构建Hoxc13基因敲除兔模型ConstructionofHoxc13GeneKnockoutRabbitbyCRISPR/Cas9作者姓名：邓吉超专业名称：基础兽医学指导教师：赖良学教授学位类别：农学硕士答辩日期：2018年12月6日中文摘要利用CRISPR/Cas9技术构建Hoxc13基因敲除兔模型纯发-甲型外胚叶发育不良(Purehairandnailectodermaldysplasia,PHNED)是一种常染色体隐形遗传疾病，主要临床

4、表现为患者自出生后全身毛发及指甲完全缺失或营养不良。该疾病可分为：外胚层发育不良头发和指甲4型、外胚层发育不良头发和指甲5型、外胚层发育不良头发和指甲6型、外胚层发育不良毛发和指甲7型、外胚层发育不良头发和指甲9型(Ectodermaldysplasia-9，ECTD-9型)五种类型。其中Hoxc13是引起ECTD-9型遗传疾病的致病基因。ECTD-9型在中国“辉”氏、叙利亚和巴基斯坦家族中的临床表现为完全缺失毛发，然而在pedigree家庭中却出现了少发的现象。这一现象暗示着Hoxc13在不同的人种或是物种之间可能扮

5、演着不同的角色。Hoxc13作为ECTD-9型的致病基因，位于人染色体12q13.13，含有两个外显子，属于Hox(Homobox)基因家族Abd-B类成员之一。Hoxc13调控着毛发相关的结构蛋白，其中包括角蛋白和角蛋白关联蛋白，与毛囊的形成和毛发的生长密切相关，并且对维持毛囊的正常形态至关重要。因此，对Hoxc13的研究有助于提高人们对毛囊发育、毛发生长机制的认识，进而揭示ECTD-9型的发病机理。科学技术的高速发展，人们希望能找到对疾病有有效的预防措施和治疗手段，但由于疾病发病机制和临床表现的复杂性，使得目前疾病

6、的相关研究仍然难以获得更大的突破。因此，建立合适的模拟人类疾病的动物模型，应用这些模型去研究疾病的发病机制、筛选治疗手段就显得尤为重要。在现有的研究中，Hoxc13缺陷小鼠和猪都不能如实的概括出少毛的临床表型，这和ECTD-9型病人显示出的临床表型不完全相符合。同时也限制了我们去理解在动物模型或是在临床上Hoxc13介导的少毛症状的分子机制。在经典的模式动物中，兔子的生理结构与人类更为相似，并有着妊娠周期短、饲养费用低等优势，是一种模拟人类疾病研究基因功能的更理想的模式动物。此I外兔子的皮肤有着更厚的表皮层和更大的弹性

7、，它与人类皮肤更为相似，暗示着兔子的皮肤更适合用于皮肤医学的临床研究。因此，本研究利用CRISPR-Cas9技术去构建Hoxc13基因敲除兔模型。本研究中，我们成功获得了Hoxc13基因敲除兔模型，并且经过检测未发现有脱靶的现象出现。对Hoxc13基因敲除兔表型鉴定，结果发现：Hoxc13基因敲除兔展示毛发和指甲发育异常，并且在一周内有较高的死亡率。在其背部和头部显示出毛发完全的缺失，在其前后肢和尾部还生长少量的毛发。另外，Hoxc13基因敲除兔在脸、四肢、背部出现了痤疮样病变。为解释这些表现的出现，首先我们通过扫描电

8、镜发现，长出的稀少毛发的毛干出现了严重表皮缺损和分隔不明确。通过RT-QPCR(Quantitativepolymerasechainreaction)结果显示，毛小皮、皮质、髓质特定表达基因出现了显著的下调。通过病理学切片的方法，其结果显示，Hoxc13基因敲除的皮肤中显示毛囊数量减少、皮脂腺增多增大以及毛囊口堵塞。我们的这些发