欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:58597063
大小:154.00 KB
页数:22页
时间:2020-10-20
《基因工程菌的构建ppt课件.ppt》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、分子生物学实验一、实验设计二、实验操作指导教师:林凤实验设计基因工程菌的构建载体目的基因酶切PCR扩增,酶切载体片段目的基因片段+连接重组质粒转化重组子阳性鉴定1、载体多克隆位点2、缓冲溶液3、温度4、末端的性质酶切位点设计载体与目的基因的连接1、粘末端2、平末端3、对照实验连接产物的转化1、核酸电泳检测2、对照实验:空白和阳性阳性重组子的鉴定1、限制性酶切法2、α-互补法3、插入失活法4、杂交筛选法constructionofexpressionvectorNcoICCATGGGGTACCXhoICTCGAGGAGCTC实验操作
2、碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18接种子液至75µg/mlAmp的5mlLB培养基37℃,OD6001.0加氯霉素100µg/ml37℃,过夜1.4ml培养液4℃,6000rpm,2min沉淀加100µl冰预冷溶液Ⅰ,剧烈振荡弃去上清,尽可能除净培养液室温,20min200µl新配制溶液Ⅱ,快速颠倒混匀冰浴5min150µl冰预冷溶液Ⅲ,温和振荡冰浴5min上清加入450µl饱和酚,混匀4℃,12,000rpm,2min上清加入450µl氯仿-异戊醇,混匀4℃,12,000rpm,2min上清加入300µl异丙醇,-20℃,3
3、0min4℃,12,000rpm离心5min500µl70%乙醇洗涤沉淀4℃,12,000rpm,2min弃上清,空气干燥10min20µlTE溶解质粒DNA4℃,12,000rpm,5minDNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定DNA的酶切与连接酶切反应体系12ddH2O19μl19μl10×buffer2.5μl2.5μl质粒DNApBR3223μlpUC183μlEcoRI0.5μl0.5μl37℃,1h65℃,10-15min终止反应取4μl样品,加入10×Loadingbuffer0.5μl,核酸电泳连接反应体系ddH2
4、O8.5μl10×buffer4.5μl酶切DNApBR32220μl酶切DNApUC1810μlT4DNAligase1μl16℃,15h取10μl连接产物,核酸电泳(上步剩余酶切产物做对照)其余连接产物用于转化重组DNA的转化(一)CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞0.3ml菌种接种于30mlLB培养基37℃,190rpmOD6000.375,冰浴10min4℃,6000rpm,10min弃上清,加4ml冰预冷0.1MCaCl2冰浴10min,4℃,6000rpm,10min弃上清,加入1ml0.1MCaCl2,分装200μl
5、/管(二)转化反应分别加入连接产物20µl,阳性对照质粒pBR3221µl,阴性对照pUC181µl,空白对照冰浴30min42℃,90s冰浴1-2min弃500µl上清,连接产物取100µl,10µl各涂一平板,空白,阳性对照和阴性对照200µl各涂一平板加入800µlLB培养基37℃水浴5min37℃,缓慢摇,复苏45min37℃,12-16h观察转化子的出现6000rpm,5min转化子DNA的快速鉴定PCR扩增技术
此文档下载收益归作者所有