苏氨酸基因工程菌的构建

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1、华东理工大学硕士学位论文第I页苏氨酸基因工程菌的构建摘要依据途径工程的基本原理，为构建大肠杆菌苏氨酸高产菌株，需强化表达苏氨酸生物合成途径中的关键基L-*1及与苏氨酸分泌有关的基因。本工作即从这两方面入手。介己构建的基因文库中通过杂交筛选得到含thr操纵子(thrA,thrB,thrC，的重组子811号，并将thr9BC亚克隆于pET-Ila质粒的T7启动子下游，得到了两表达质粒pTHIIa-07和pTHIla-08，分别转化于E.coliBL2I(DE3)进行表达研究，通过SDS蛋白电泳检测均有高明恳夕的蛋一白表达，而发酵液中苏氨酸产生量仅pTHIla-081BL21{DE

2、3)与对照菌相比略有提采用PCR法克隆到了与苏氨酸分泌有关的rhtB,rhtC基因，将rhtB克隆于T7启动子构建了表达质粒pthB-T03,而rh‘则利用自身的启动子构建了表达质粒prhC-P，分别将之转化入相应受体，对其进行表达研究，通过SDS蛋白电泳检测均没有明显的蛋白表达:对E.coliBL21(DE3)1pthB-T03发酵液中苏氨酸的含量分析，其与对照BL2I{DE3)也没有明显提高，而将苏氮酸生产菌E.coliVNBKB-3507中引入质粒prhC-P后，经48小时发酵，结果其苏氨酸的产生量比对照菌株增加87.54%,说明引入外源性的rhtc基因并使之强化表达后

3、，能够加速苏氨酸的分泌，从而解除了苏氨酸在胞内的积累，最终能大幅度提高产量。关键词:苏氨黔‘操纵子夕分泌基因htC第11页华东理工大学硕士学位论文ConstructionofThreonineHigh-producingGeneticStrainAbstractBasedontheprincipleofpathwayengineering,thecopiesofthekeygenesrelativetothethreoninebiosynthesisandsecretioncanbeincreasedtoconstructthreoninehigh-producingstra

4、inFirstly,therecombinant811wasselectedwhichcontainsthrABCfromE.colirestrictedgenelibrary.TwoplasmidsnamedpTHlla-07andpTHIla-08wereconstructedtoexpressthegenes.Over-expressedproteinswereobservedbythemethodofSDS-PAGE,whiletheproductivityofthreonineinfermentationofpTHIla-08/BL21(DE3)increaseds

5、lightly.Ontheotherhand,rhtBCgenes,whicharerelatedtothreoninesecretion,wereclonedbythemethodofPCR.TherhtBgenewasexpressedundertheT7promoterinpthB-T03andtherhtCgenewasexpressedundertheoriginalpromoterofthefragmentinpthC-P.ThereisnoremarkableexpressiondetectedbythemethodofSDS-PAGE.Theincreaseo

6、fthreonineproductivitywashardlyobservedinE.coliBL21(DE3)/pthB-T03fermentation.Theproductivityofthreonineincreasedby87.54%whenplasmidprhC-PwastransformedtoE.coliVNBKB-3507.ThereforeweconcludedthatrhtCgenewasover-expressedandthesecretionofthreoninewasgreatlyincreased.Keywords:threonine,thrABC

7、,rhtC作者声明我郑重声明:本人咯守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的结果。除文中明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何他人己经发表或撰写过的内容。论文为本人亲自撰写，并对所写内容负责。论文作者签名:;i电}uh.r`3,之0'2年Jz月.xa日华东理工大学硕士学位论文第1页第1章综述与导言1.1苏氨酸的功能川在人体和动物所需的八种必需氨基酸中，苏氨酸是仅次于蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸的第四种氨基酸。苏氨酸在人的生长发育中发挥越来越重要的作用，被广泛