丹参迷迭香酸合酶基因（smras）特异性沉默对酚酸类成分合成的影响

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1、分类号Ｒ２８密级公开学号１２２１２１＾：ｉｍｍ硕ｄ：学位论文（学术型）题目丹参迷迭香酸合酶基因化ｉＳ）特异性沉默对酷酸类成分合成的影响作者王仕英指导教师王詰之教授一级学科名称中药学二级学科名称中药学提交日期二０—五年五月■？■学位论文原创巧声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行研巧工作所取得的研巧成果，，尽我所饥除文中已经注明引用的内容和致谢的地方外本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研充成果，也不包含本

2、人或他人已申请学位或。其他用途使用过的成果对本文的研巧做出重要贡献的个人和集体，均己在文中作了明确说明并表示谢意。一本学位论文若有不实或者侵犯他人权利的，本人愿意承担切相关的法律责任。如＾：日作者签名：少裏日期〇年月＞（ｒｒ＞之学位论文知识产权及使用授权声明书本人在导师指导下所完成的学位论文及相关成果，知识产权归属陕西师范大学。本人完全了解陕西师范大学有关保存、使用学位论文的规定，允许本论文被査阅和借阅，学校有枚保留学位论文并向国家有关部口或机构送交论文的纸质版，可＾采用和电

3、子版，有巧将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索！任何复制手段保存和汇编本论文。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时著名单位仍为陕西师范大学。保密论文解密后适用本声明，作者签名：＾知襄日撕訓ｒ年广月》＾日摘要’沁’丹参（況化ｗｚ化０／ｒＡｂａＢｕｎｇｅ）是唇形科多年生药用植物，广泛分布于我国大部分地区，，。丹参的主要药用部位为根和根茎作为我国重要的传统中药在临、床上有悠久的用药历史。在传统用药中，丹参多被用于治疗屯脑血管疾病、各种炎症及月经不调等。现代药理学研究证实，

4、丹参的主要药理活性成分可分为性一质不同的两大类：类为脂溶性的丹参丽类物质，包括丹参丽ＩＩＡ和隐丹参丽等；一另，包括丹酷酸Ｂ和迷迭香酸等，类为水溶性的酷酸类化合物。己有研究表明丹参酶酸类物质由酪氨酸和苯丙烧类两条代谢途径共同参与合成，中间产物迷迭香酸是合成丹献酸Ｂ的核屯、前体。目前己知代谢途径上的多个关键酶基因被克隆和研究，但对于迷迭香酸合酶（奶７化４５）的研究还较少。本实验１＾＞１丹参迷迭香酸合酶基因（訊７化佔）为研究对象，构建人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）表达载体，对加化佔基因进行特异性干涉，

5、从而对该基因的功能进行初步研究。探讨迷迭香酸合酶基因与丹参酪酸类代谢物合成之间的相关性，为阐明丹参中主要水溶性活性成分合成的分子机制提供依据，同时也为利用基因工程对丹参品质进行改良奠定基础。主要研究内容及结果如下：１．选取加化４５基因的非保守区域为祀位点，利用ＷＭＤ３（ＷｅｂｍｉｃｒｏＲＮＡｄｅｓｉｇｎｅｒ软件设计靴向拥化４Ｓ的ａｍｉＲＮＡｓ序列，然后Ｗ拟南芥ＭＩＲ３１９ａ前体序）列为骨架－，利用重叠ＰＣ民ｏｖｅｒｌａｉｎＰＣＲ技术置换ＭＩＲ３１化的前体序列中的（ｐｐｇ）＊ｍｉＲ３１９ａ／ｍｉ

6、Ｒ３１９ａ部分，获得ａｍｉＲＮＡ前体序列；再将其插入到ｐＣａｍｂｉａｌ３０２载体中的３５Ｓ启动子和Ｎｏｓ终止子之间，构建得到特异性沉默細化仪的ａｍｉＲＮＡ过表达植物载体。２．分别提取野生丹参根、茎、叶的ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡ，利用实时定量ＰＣ艮技术研究筑Ｗ化４Ｓ基因在不同组织中的表达丰度。结果表明，况７义４５基因在丹参的根、茎、叶等组织中均有表达，但在根中表达丰度最高，茎中次么，叶中含量最低。３．利用叶盘转化法浸染野生丹参叶片，经ＤＮＡ和ＲＮＡ水平筛选检测，得到９－个生长良好的阳性转基因株

7、系，利用半定量ＰＣＲ、ＰＣＲＳｏ山ｈｅｍｂｌｏｔｉｎｇ和实时笑？光定量技术对阳性株系进行检测。结果表明，转基因阳性株系中基因表达量显著低于野生对照株系，而ａｍｉＲＮＡ表达量均显著高于对照，说明本实验构建的ａｍｉＲＮＡ前体序列能够在丹参细胞内被正确的识别、加工和最终实现ａｍｉＲＮＡ的表达，从而达到了特异性沉默範基因的效果。其次，对转基因株系中化４５在Ｉ不同组织中的表达模式分析发现，讯７化在转基因株系的不同组织中的表达模式一与巧生株系相。致，且表达量均低于野生丹参各组织中的表达量４．对干涉及对

8、照株系的组织培养试管苗中总酌酸含量检测发现，Ｈ个被检的干涉株系中总酌酸含量巧低于对照株系。３＃、６＃、１４＃株系的总酌酸含量分别为对照的４５．３４％、％２２％和２８．４８％。５．利用ＨＰＬＣ技术检测转化丹参的６０ｄ龄实生苗的根中迷迭香酸和丹酪酸Ｂ。Ｈ个转基因株系较对照株系的迷迭香酸和