玫瑰微球菌海藻糖合成相关酶基因克隆以及基因工程菌构建表达

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1、北京化工大学颈上学位论文玫瑰微球菌海藻糖合成相关酶基因的克隆以及基因工程菌的构建表达摘要海藻糖(Trehalose，。【一D-glucopyranosyl一0【-D—glucopyranoside)是由两个葡萄糖分子经半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖，其具有的独特生物学特性可以保护生物大分子抵抗不良的环境压力。近年来，其广泛的应用前景引起了各国科学家对其研究的极大兴趣。本文首先克隆了玫瑰微球菌QS412r扣产海藻糖相关酶体系基因，并对其进行生物信息学分析，其次构建了融合表达载体，为以后利用基因工程

2、方法发酵生产海藻糖进行了初步的探索。从Bertebank上搜索已经公布氨基酸序列的其它物种中海藻糖合成酶蛋白，通过VectorNT9．0中Align的同源性对比，找到了两个高保守区域设计简并引物，PCR分别扩增了这两个片断，利用克隆的片断测序得到的序列分别设计特异引物进行特异PCR和反向PCR，再经过序列拼接，得到了玫瑰微球菌QS412中双酶体系新基因。运用生物信息学对克隆的双酶基因进行分析，初步了解了这两酶蛋白的基本性质。根据已经克隆基因序列设计合适的引物，PCR扩增后T／A克隆与PGEM～T连

3、接，测序鉴定其正确后，BamHI／EcoRI双酶切后连接入pET-28(a)@，构建成融合表达载体，发酵表达，初步证实了所克隆T北京化工大学烦士学位论文基因所表达的蛋白是我们想要的蛋白，为以后利用基因工程高产海藻糖奠定了基础。关键词：海藻糖，克隆，玫瑰微球菌，融合蛋白II北京化工大学硕七学垃论文CLONING，EXPRESSIONOFACLUSTEROFGENESENCoDINGNEWTREHALoSE．PRODUClNGENZYMESFROMMICROCOCCUSROSEUSQS412ABSTR

4、ACTTrehalose(洳D—glucopyranosyl(1-1)一a-D—glucopyranoside)isanon-reducingdisaccharideconsistingoftwoglucosemolecules．Inmanyorganisms，thehaolseprotectsagainstseveralenviromentalstress，suchasheat，desiccation，andsalt，probablybystabilizingproteinstructuresa

5、ndlipidmembranes．Thewiderangeofapplicationsofthissugarhasincreasedtheinterestofmanyresearchgroupsintothedevelopmentofnovelandeconomicallyfeasibleproductionsystems．Twogenes(treYandtre西encodingfortrehalose-producingenzymes，amaltooligosyltrehalosesynthas

6、e(MTSase)andmaltooligosyltrehalosetrehalohydrolase(MTHase)hadbeencloned，expressedandsequencedfromMicrococcus(QS41矽inthisthesis．Toclonethegenes，twohigherhomologousregionsweredetectedtobeamplifiedwitlldegeneratePCRthroughtheprocedureAlignofVectorNT9．0．T

7、hespecificPCRandinversePCRwererunaccordingtothe111北京化工人学硕士学位论文clonedsequences，whichmadeUSgetthefullORFofthegenes．ThegenesofweZandtreYwereclonedbyusingQS412genomicDNAastemplatewithPCRamplification．ThePCRproductswerepurifiedandclonedintoplasmidpGEM-Tand

8、pET-28(a)，followedbytransformingintoE．coliDH5a，respectively．TheclonedPCRproductsshowthattheexpressionvectorwiththeinterestgenesundercontrolofPET-28(a)areconStructedKEYWORDS：trehalose，clone，micrococcusroseus，fusionprotein学位论文数据集中图分类号TQ．028学科分类号