毕赤酵母谷胱甘肽高产工程菌的构建

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万方数据分类号：密级：中文论文题目：洳≥：j、嘧硕士学位论文⑧单位代码：!Q三三5学号：21lQ2Q鱼2英文论文题目．一ConstructionofEngineeringPichiapastoris．．StrainsforHighGlutathio—n—e—P———r——o———d———u———c———t——i—o———n—． 万方数据JlUllIIIllllllllllIIIIIIIY2665815ADissertationsubmittedtoZhejiangUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofMasterofScienceGlutathioneProductionCandidate：Jian．BoLiuSupervisor：Yong一-QuanLi,ProfessorCo-advisor：Wen-JunGuan,Profess—o—rSubjectCollegeBiochemistryandMolecularBiology_．CollegeofLifeSciencesSubmittedDateJune，2014 ⑧万方数据论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4．评阅人5：答辩委员会主席：——(姓垒＼职称＼望鱼)委员1：委员2：委员3：委员4．委员5： 万方数据英文论文题目：一ConstructionofEngineeringPichiapastoris—StrainsforHighGlutathioneProduction⑧Author：Jian—BoLiuSupervisor：至ro坠g：Q丛垒塾坠iExternalReviewers：(姓垒3壁整3望焦，王回)ExaminingCommitteeChairpersonExaminingCommitteeMembers：Dateoforaldefence：June7恤，2014 万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：扫翰7噻／签字日期：驯严年石月z歹日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授杈堑姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：否协办钨签字日期：酬降6月哆导师签名签字日期：年月日 万方数据浙江大学硕士学位论文摘要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合成的三肽，是细胞或组织内存在的重要的非蛋白类含硫物质。它具有非常重要的生理功能和临床应用价值。目前GSH最主要的生产方法是微生物发酵法，选用的菌株多为酵母。在传统的诱变育种之后，基因工程定向改造方法使用越来越广泛。毕赤酵母是使用非常广泛的真核蛋白表达体系，它作为表达宿主具有很多优势，如具有严密调控的高效启动子，可以高密度发酵，外源蛋白不会过度糖基化等。本论文通过在毕赤酵母中以GAP启动子高效表达来自酿酒酵母的GSH合成酶基因sGSHl和sGSH2，构建毕赤酵母谷胱甘肽高产工程菌。因胞内GSH的过量积累会造成GSH合成酶Gshlp受到反馈抑制，从而导致酶活性减低，不能有效提高谷胱甘肽的产量。基于此，本论文在已有的酿酒酵母谷胱甘肽转运体系研究的基础上，改造了毕赤酵母的谷胱甘肽转运蛋白，以促使胞内积累GSH的外排，减小GshlP受到的反馈抑制，最终达到提高GSH总产量的目的。本论文构建了一个多基因改造的工程菌株JC312(口叫，sGSHJ，sGSH2，opt]，sGEXl)，即在毕赤酵母JC308(adel，d叫，his4，ura3)ee表达了GSH合成酶基因sGSHl和sGSH2，同时敲除吸收转运子OPTI，并过表达外排来源于酿酒酵母的转运子sGEXl。通过此一系列的改造，GSH的摇瓶产量相对于初始菌株提高了90％，8L发酵罐发酵后产量在摇瓶发酵基础上又提高了一倍，达到173mg／L。关键词：谷胱甘肽，毕赤酵母，GAP启动子，转运子，高产工程茵 万方数据浙江大学硕士学位论文AbstractGlutathione(GSH)，iscomprisedofL·glutamicacid，L-cysteineandglycine．GSHisthemostabundantnon—proteinthiolcompoundwidelydistributedinlivingorganismsand，predominantly,ineukaryoticcells．GSHplaysprettyimportantrollsinthecellorthetissue．Recently，themostlyusedmethodtoproduceGSHisfermentationwithpropermicroorganisms，usuallyyeasts．Beyondtraditionalmutationbreeding，genemodificationismoreandmoreextensivelyused．Theyeastpichiapastorishasbecomethepremierexampleofyeastspeciesusedfortheproductionofrecombinantproteins．Advantagesofthisyeastforexpressionincludetightlyregulatedandefficientpromotersandastrongtendencyforrespkatorygrowthasopposedtofermentativegrowth．Inthisstudy，anengineeringpichiastraintoproducehighamountofGSHwasconstructed，inwhichthetwoGSHsynthetaseswashighlyexpressedundertheGAPpromoter．BecauseoftheaccumulationofintracellularGSH，GshIpisdepressedbyfeedbackinhibition，theconsequenceofwhichGSHproductionisdecreased．BasedOffthis，inthisstudythetransportersofpichiapastoriswasmodifiedtoincreasetheeffluxofGSH，SOthatGshlpwasreleasedfromthefeedbackinhibitionofGSHandthefinalGSHyieldisimproved．InthisstudyanengineeringstrainJC312(ar94，sGSHl，sGSH2，optl，sGEXl)wasobtainedbasedOfftheinitialstrainJC308(adel，ar94，his4，ura3)，inwhichGSHsynthetasessGSHIandsGSH2washighlyexpressed，andtheGSHimporterOPTlwasknockedout．whiletheGSHexportersGEXlwasover—expressed．Withthisnewlyconstructedstrain，theGSHproductioninshake-flaskincreased90％，andeven2．foldincreasedin8Lfed—batchfermentation．Keywords：Glutathione，Pichiapastoris，GAPpromoter，Transporters，Highproductionn 万方数据浙江大学硕士学位论文缩略词缩略词和术语表ⅡI 万方数据浙江大学硕士学位论文目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．II缩略词和术语表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1II目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Iv第1章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．谷胱甘肽的生理生化性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1理化性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2生理功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22．谷胱甘肽在细胞内的代谢途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33．谷胱甘肽的生产方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33．1提取法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33．2化学合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43．3酶法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．43．4发酵法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44．谷胱甘肽的定量方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54．1分光光度计法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54．2荧光试验法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54．3HPLC法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55．酵母细胞中谷胱甘肽的转运体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65．1外排转运蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65．2内向转运蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．66谷胱甘肽的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯77毕赤酵母表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87．1毕赤酵母简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．87．2GAP高效表达体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯98本论文立项意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第2章实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．1菌株及质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．2主要仪器设备·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．3引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．1．4培养条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．5酶及生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．6常用试剂配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2．1PCR程序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2．2质粒抽提、酶切、电泳、胶回收、DNA片段连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2．2大肠杆菌感受态细胞制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．172．2．3大肠杆菌转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17Iv 万方数据2．2．4毕赤酵母电转化感受态的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．172．2．5毕赤酵母电转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．6酵母基因组抽提⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．7酵母总RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2．8荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．9谷胱甘肽的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．10发酵罐发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2．11HPLC测定谷胱甘肽⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22第3章谷胱甘肽高产工程菌的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．1转运蛋白生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．2载体构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253_3菌株构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．4基因表达水平分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．5谷胱甘肽的HPLC检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．6摇瓶发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．7发酵罐发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32第4章结论与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯354．1本文研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯354．2展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．_35参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37攻读硕士学位期间的主要研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43V 万方数据浙江大学硕士学位论文第1章第1章绪论谷胱甘肽(GSH)最早于1888在酿酒酵母的乙醇提取物中被发现，当时命名为“Philothion”。1921年谷胱甘肽的结构被解析出来，并被重新命名为“Glutathione”【11。谷胱甘肽是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的具有重要生理功能的三肽化合物。谷胱甘肽在细胞内涉及蛋白质、DNA的合成、转运，酶的活性，新陈代谢及细胞自我保护等方方面面。正因为谷胱甘肽如此多样化的生理功能，研究人员对它的研究越来越深入，包括谷胱甘肽的合成酶运转抑制及其活性位点，谷胱甘肽的体内代谢、转运，谷胱甘肽在氧自由基的清除、解毒、药物抗性、衰老等方面的功能等许多领域。1．谷胱甘肽的生理生化性质1．1理化性质谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽。其化学名为：N-(N-L吖一Glutamyl—L-cysteinyl)glycine，即N-(N吖-L一谷氨酰一L一半胱氨酰)甘氨酸。GSH的化学结构如图1．1，其中谷氨酸以十羧基和半胱氨酸结合形成肽键。GSH的结构中存在一个游离的巯基，它广泛的生理功能就是由这个巯基决定的。GSH的相对分子质量为307．33，，氮量为13．67，硫量为10．44，旋光度Ⅱ为21．3(27。C，2％水溶液)，熔点189～193。C(分解)，晶体呈无色透明细长柱状，等电点为5．93，溶于水、液氨和二甲基甲酰胺，不溶于醇、醚和丙酮[21。严峄墨2c％CHrAC：NI'I-戳．NH-CHz-HOO乇o；uH；7-glutamylq，sleinyl913’cine图1．1谷胱甘肽的结构 万方数据1．2生理功能谷胱甘肽是细胞中最重要的含硫非蛋白类化合物，动物肝脏，小麦胚芽和酵母等组织或细胞中都含有丰富的谷胱甘肽。其所具有的游离巯基(．SH)是细胞对抗氧化压力主要手段。谷胱甘肽在细胞内存在两种形态，即还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)[31。还原型谷胱甘肽的巯基被氧化后形成两分子的聚合体，即氧化型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽在大多数细胞内的含量都在毫摩尔水平(肝脏中可达到5～10mM)，而氧化型谷胱甘肽的含量不到还原型的l％【4]。谷胱甘肽在组织或细胞中具有重要的生理功能：(1)维持细胞内的氧化还原稳态。谷胱甘肽是细胞体内重要的还原性物质。GSH和GSSG的平衡是维持细胞或组织内氧化还原稳态的重要保证。GSH在和自由基或者过氧化物等有害物质反应后生成GSSG。而GSSG在谷胱甘肽还原酶及NADPH的作用下又可以转化成GSH．GSH和GSSG的动态平衡使细胞或组织内的氧化还原电势得以保持相对稳定。(2)抗氧化GSH作为细胞内重要的还原性物质，其在清除胞内的自由基、过氧化物等方面发挥重要作用．GSH还可以保护细胞内蛋白质的巯基不被氧化，使得蛋白质得以发挥正常的生理功能。(3)谷氨酰循环丫．谷氨酰循环是细胞转运氨基酸的重要途径。胞外的氨基酸和胞内的谷胱甘肽在跨膜的丫．谷氨酰转移酶的作用下形成丫一谷氨酰氨基酸，从而使得胞外的氨基酸进入胞内，然后在y．谷氨酸环化转移酶的作用下再生成相应的氨基酸。(4)解毒GSH能与细胞内的异源有毒物质或者重金属离子(如铜离子、锌离子等)结合，并促使其排除胞外，从而使细胞免受毒害[51。 万方数据2．谷胱甘肽在细胞内的代谢途径谷胱甘肽由细胞质中的两种可溶性酶Y．谷氨酰半胱氨酸合成酶(I'-GCS，Gshlp／GshA，EC6．3．2．2，GSHl)和谷胱甘肽合成酶(GS，Gsh2p／GshB，EC613．2．3，GSH2)所催化的序列反应所合成[2]。这两种酶都是ATP依赖型合酶。第一步是在I'-GCS作用下L．谷氨酸和L．半胱氨酸缩合成丫．谷氨酰半胱氨酸；第二步是Gs将L．甘氨酸连接至T-GC的c端位点从而形成谷胱甘肽。谷胱甘肽的合成与降解是丫一谷氨酰循环的组成部分。细胞内的谷胱甘肽含量不仅与两种合成酶的水平与活性有关，还与ATP及三种前体氨基酸(谷氨酸，半胱氨酸，甘氨酸)的含量密切相关。GCS的活性会受到胞内累积的GSH(不是GSSG)的反馈抑制【61，这是胞内GSH不能达到相对高产量的因素之一。有文献报道通过筛选耐反馈抑制的GCS来提高GSH产量。另一种可行的策略就是通过增加GSH的外排来防止胞内GSH的累积，这也是本论文的创新点所在。1，一谷氨酰转肽酶(y-GT，EC2．3．2．2)是酵母中唯一确定的GSH降解酶。y-GT催化将GSH的丫-谷氨酰基团转移至氨基酸上，也能将GSH的十谷氨酰基团直接水解。酿酒酵母的y-GT已经被证实定位在液泡膜上【7】．L．半胱氨酰甘氨酸二肽酶(CGase，EC3．4．13．6)是催化GSH水解的另外一个酶。它可以将L．半胱氨酰甘氨酸水解成半胱氨酸和甘氨酸。酿酒酵母中的CGase定位在液泡膜上【8】。在其他一些微生物和哺乳动物中，L-半胱氨酰甘氨酸二肽酶存在一系列类似水解酶，而在酿酒酵母中目前只发现这一种酶【9，10]。3．谷胱甘肽的生产方法3．1提取法谷胱甘肽提取原料主要是酵母和植物组织。主要包括粗提取及层析提纯等步骤．粗提取GSH的方法包括热水抽提‘1¨、渗透法、丙酯法、40％乙醇抽提等，提纯方法则有离子交换层析，金属汞亲和层析等。 万方数据3．2化学合成化学合成法是通过一系列化学反应，直接利用谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。目前GSH的化学合工艺相对成熟，但是其仍有明显的缺点，如反应条件苛刻，需要进行基团保护，反应液成分复杂掣121。另外化学合成的GSH是消旋体，需进行光学拆分，成本相对高昂。3．3酶法酶法合成是在体外环境中以Y一谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶作为催化剂合成谷胱甘肽。酶法合成的优势是GSH可以达到相当高的浓度。但是其需要添加前体氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)，增加了生产成本。酶法合成谷胱甘肽的体系中基本成分为合成酶GSHI、GSHII，前体氨基酸，ATP，M92+以及合适的pH(一般为7．5)。酶法的关键是筛选得到高活性的谷胱甘肽合成酶系，并且它们能在体外环境中保持足够的稳定性。由于谷胱甘肽合成途径中两个酶促反应都是ATP依赖型的，所以反应体系中必须添加ATP。而对于大规模工业化生产来说这显然不现实。一种行之有效的解决方式是，设计体外ATP再生体系，只要添加廉价的碳源，就可以通过一系列酶促反应产生ATP，供给谷胱甘肽的合成所需。Murata等发现酿酒酵母的糖酵解途径是最简单可行的ATP高效再生系统【131。3．4发酵法发酵法是目前生产谷胱甘肽的最优方法，主要是利用酵母或者大肠杆菌等微生物进行发酵生产。发酵法可以规避提取法原料不足及化学合成法的诸多缺点，而且只需要使用相对低廉的发酵原料。发酵法最核心的部分是获得谷胱甘肽生产能力强的菌株。主要的方法有基因诱变育种及基因工程定向改造。诱变育种是采用一系列诱变环境或者诱交试剂，如紫外照射，HN02，硫酸二乙酯处理等，使原始菌株发生随机突变，然后利用谷胱甘肽代谢类似物乙硫氨酸或者氯化锌等【14】来筛选高产GSH的菌株。基因工程改造主要是外源表达谷胱甘肽合成基因。表达体系主要是大肠杆4 万方数据堑婆盔堂亟±堂鱼途塞筮!童菌和毕赤酵母，以酿酒酵母作为宿主菌的研究也有报道。4．谷胱甘肽的定量方法4．1分光光度计法早在1959年【l5]或者更早之前，已经有一些文献报道了检测生物样品中巯基化合物和谷胱甘肽的方法。在所有的光谱检测法中，由Owens[161开发并由Tistze[17]改进的基于酶循环反应的检测法最为经典。这种方法可以测定样品中的总谷胱甘肽含量，这比使用Ellma试剂的灵敏性要高得多。这种方法的原理是用谷胱甘肽还原酶将GSSG还原为GSH，并使用DTNB，即5，5’．二硫代双(2．硝基苯甲酸)络合，然后在412nm处检测络合物的吸光度。这种方法并不会受到其他含硫化合物的干扰。而使用N．乙酰马来酰亚胺(NEM)封闭巯基则可以分别测定还原型和氧化型谷胱甘肽的浓度[181。4．2荧光试验法Cohn和Lyle[191使用0．邻苯二甲醛(OPA)来对GSH进行荧光检测。这种方法测定分辨率可以达到徽克以下级别。OPA作为荧光试剂，可以和GSH的游离巯基结合，并产生一种释放强荧光的衍生物。该方法主要的缺点是只能测定含巯基物质的总量，所以会受到氨基酸和其他含硫物质的干扰。4．3HPLC法高效液相色谱(HPLC)法是最灵敏的检测方法。对于长碳链的反向色谱柱来说，GSH的极性偏大，保留时间过短，无法完全区分吸收峰，所以一般的考虑是对GSH进行络合衍生后再进行HPLC分析。Reeve等[20】最早报道了使用DTNB作为衍生剂进行GSH的HPLC分析。Katrusiak等[21】进一步改进了Reeve的方法，使得它可以同时检测谷胱甘肽和其他巯基类物质。而GSSG的测定则通过二硫苏糖醇将其还原为GSH来进行。另一种使用较广泛的衍生剂是2，4．二硝基氟苯(即Sander试剂)。该方法最早由Reed等[22]开发。Yoshida等【23】改进了Reed的方法，使用偏磷酸对分析样品进行脱蛋白，然后以碘乙酸 万方数据堑婆盍堂亟±堂焦丝塞蒸!童封闭游离巯基，防止GSH被氧化为GSSG。这种改进使得其可以同时测定GSH和GSSG及其衍生物。另一种HPLC方法是使用离子对试剂，如庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、十二烷基硫酸钠等。Riley等[241使用庚烷磺酸钠作为离子对交换试剂，通过反向HPLC检测含游离巯基的甲硫氨酸。庚烷磺酸钠这类离子对试剂具有极性和非极性双末端，非极性端与反向色谱柱的疏水链结合，而极性末端则可以结合GSH，从而增加了GSH在反向色谱柱上的保留时间。5．酵母细胞中谷胱甘肽的转运体系5．1外排转运蛋白在酿酒酵母中，Gexlp及其同源蛋白Gex2p是定位在细胞质膜和液泡膜上的GSH外排转运蛋白。Gexlp，Gex2p属于MFS家族(MajorFacilitatorSuperfamily)。最初的系统生物学分析结果显示该蛋白为铁载体转运蛋白。Dhaouil25】发现过表达Gexlp会导致胞内GSH含量降低，并且胞质发生酸化，而其敲除株则表现出胞内GSH积累。这些证据表明Gexlp其实是谷胱甘肽的质子反向偶联转运子。MRP(multidrugresistance-associatedprotein)家族的Yctlp[261BptIp[27]也表现出低活性的谷胱甘肽转运能力。这些ABC(ATP．bindingcassette)转运蛋白可以将胞质中的GSH转运进入液泡中。但是Ycflp和Bptlp的转运GSH的活性很低，其Km分别为15mM和3mM。不过这两个蛋白转运GSSG和谷胱甘肽衍生物的活性却要高许多(Km达到州级别)。Kiriyama[281通过筛选酿酒酵母中和人源GSH外排ABC转运蛋白的同源蛋白发现了一个新的GSH转运子—Gxalp。在酿酒酵母中过表达Gxalp能使GSH的胞外含量提高2,3倍。但是这些发现还需要进一步的直接证据来证明。5．2内向转运蛋白Hgtlp(OptIp)‘291是酿酒酵母中GSH的高活性内向转运蛋白．Hgtlp属于OPT(oligopeptidetransporterfamily)家族。先前的报道已经证实其是寡肽 万方数据转运蛋白(也记为Scoptip)【3们。它可以转运leu。脑啡肽(呷ly_Gly呻he_Leu))及met-脑啡肽(胛ly坷ly-Phe-MetBourbouloux[291发现在HGTl敲除株中完全检测不到培养基中添加的放射性标记的GSH，而HGTl和GSHl双敲的孢子无法生长，首次证实了Hgtlp是GSH的高活性转运蛋白。Hgtlp对GSH、GSSG、GSH衍生物(GS．NEM)等都具有转运活性。Hgtlp在其他酵母和植物中存在多种同源蛋白，而在其他真核生物中则没有发现。Thakur[311在粟酒裂殖酵母中鉴定了一种Hgtlp的同源蛋白Pgtlp。研究发现酿酒酵母中HGTl基因受制于强烈的硫代谢调控【321。但是在HGTl的启动子区域却没有发现已知的硫代谢调控元件。不过Srikanth[331在．356～．364区域发现了一个新的反式元件(CGCCACA)。该元件在．333—一340区域还有一个拷贝。HGTl处于经典的Met4p依赖性硫代谢调控网络中[34]。Hara等【351在酿酒酵母中过表达METl4和METl6基因分别使谷胱甘肽产量提高了1．2和1．4倍。此外HGTl的表达还受到氨基酸传感蛋白的调控【361。粟酒裂殖酵母的谷胱甘肽转运蛋白P磬1p以及假丝酵母中的Opt7p也同样受到硫代谢的调控【31，”t．6谷胱甘肽的应用由于谷胱甘肽在细胞或组织中的重要生理功能，其在医药，食品，化妆品等领域的应用越来越广泛。目前谷胱甘肽的原料市场缺口巨大，因此研究人员对提高谷胱甘肽发酵产量越来越关注。谷胱甘肽在医药领域的应用主要有：(1)保护肝脏，抑制脂肪肝形成，治疗中毒性肝炎及感染性肝炎(2)防止红细胞溶血及血红蛋白中二价铁的氧化(3)降低化疗药物毒性，提高癌症患者对化疗的耐受性(4)对一氧化碳、重金属及有机溶剂中毒的解毒治疗(5)缓解缺氧血症、恶心及肝脏疾病引起的不适(6)延缓进行性白内障导致的失明(7)防止皮肤色素沉积，改善皮肤光泽 万方数据(8)治疗囊性纤维化病、帕金森病、阿尔兹海默症、以及一些老年性疾病(9)对艾滋病的治疗也有一定功效【38】谷胱甘肽作为食品添加剂的应用也广泛。在肉类、奶类、鱼类和海鲜类中添加谷胱甘肽可以延长保鲜期，保证食物的风味不会改变。此外在果品罐头中的使用可以防止果肉褐变。谷胱甘肽在保健品的使用也很广泛。正因为谷胱甘肽强大的抗氧化能力，其在化妆品领域中的地位也越来越高。谷胱甘肽类化妆品具有美白，清除自由基，抗衰老等一系列功用。7毕赤酵母表达系统7．1毕赤酵母简介作为单细胞微生物，毕赤酵母很容易培养及进行遗传操作。相较于大肠杆菌等原核表达体系，毕赤酵母作为蛋白表达宿主菌的优势是其具有许多高等真核细胞类似的翻译后修饰，如蛋白折叠，二硫键形成及糖基化等。而和其他酵母相比，毕赤酵母表达外源蛋白没有过度糖基化的问题。而且毕赤酵母可以高密度培养。在遗传操作水平上，毕赤酵母表达体系具有可严密调控的启动子(AOXl)【391。Cregg[401通过诱变筛选获得了具有四种营养缺陷的毕赤酵母菌株(JC308，adelar94his4ura3)。该菌株的显著增加了毕赤酵母基因操作中可用的筛选标记，为毕赤酵母多基因表达奠定基础。本论文选用JC308作为出发菌株进行谷胱甘肽高产工程菌的研究。毕赤酵母可以利用甲醇作为唯一碳源。醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的笫一个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛．在毕赤酵母中共有两个基因表达醇氧化酶(AOXI及AOX2)[4q，而AOXl产生胞内绝大部分的醇氧化酶活性。AOXl启动子受到严密调控，并可以被甲醇诱导到高效转录起始水平。在培养基中有葡萄糖或甘油存在时，AOXl被完全阻遏。在单纯的甲醇碳源摇瓶培养条件下中，AOX]表达量一般占所有可溶性蛋白的5％左右，而以甘油为碳源进行培养并在对数生长期以甲醇诱导时，其蛋白含量则可以达到30％[421。 万方数据堑适盔堂亟±堂丝途塞簋!童7．2GAP高效表达体系AOXI启动子的优势是可以选择性诱导表达，因此对于某些细胞毒性蛋白的表达A03(1启动子也适用。但对于一些需要大量表达的非毒性蛋白来说，AOXI启动子活性就显得有所欠缺。在工业化生产药源蛋白质时，甲醇的存在也是一个不安全因素。GAP启动子来源于甘油醛一3．磷酸脱氢酶，它不需甲醇诱导，能持续性地起始高效转录。使用GAP启动子在毕赤酵母中表达B．内酰胺酶的产量远远高于使用AOXl启动子【431。8本论文立项意义谷胱甘肽在生物体中具有广泛的生理作用，也因此它在实际应用领域具有非常大的潜在市场空间。本论文通过在毕赤酵母中高效表达外源谷胱甘肽合成基因，探究毕赤酵母的谷胱甘肽转运体系，以达到构建毕赤酵母谷胱甘肽高产工程菌的目标。本论文的创新点在于，从改造毕赤酵母谷胱甘肽转运体系角度来降低胞内GSH的累积，提高GSH的外排，进而降低GSH合成酶所受到的反馈抑制，最终达到谷胱甘肽高产的目标。 万方数据浙江大学硕士学位论文第2章2．1实验材料2．1．1菌株及质粒大肠杆菌克隆菌株：TGI第2章实验方法质粒描述来源仪器型号厂家10 万方数据引物序列5’--3’ 万方数据逝适盔堂亟±堂焦迨塞墓!童P7，GSH2N．FP8，GSH2N—RP9，pGAe-FP10，His4．FP11，His4．RP12，OPTup一1．2FP13，OPTup-1．2RP14，0PTdown-I．2FP15，0PTdown-1．2RP16，OPTUP17，OPTDP18，Ura．UP19，0PT_XP20，URA3—5P21，URA3．3P22，Adel．5P23，Adel．3P24，sGEX．FP25，sGEX．R黑体为么p甜酶切位点TTGp(I'AAGAAAAAGGGTACTArAGGATCACTAGTTGTAGAGTCCClⅪTTCAArCAATTGAAAGATCTTTAA／气TAAGTCCCAGTTTCTC黑体为Bglll酶切位点AGATCTATGACATTTCCCTTGCTACC黑体为Bglll酶切位点GAAGTTATTAGGTCTAGACTTTGATGGGGTCACGGA黑体为载体同源序列GCTTGAGAATGGTCTTCACGGGACAACTTCTCGCAC黑体为载体同源序列’rAGGTGATATCAGATCCATGGCACTGTCGTTCGTC黑体为载体同源序列CCGCGGCCGCATAGGCCATGCGJ～：丌GACTCGTTAT黑体为载体同源序列AGAACTACAGCTCTGCGGAGCCCCACATGCTGATTAGTGCTAGACAArGGCTCGCAGTTATGArCA兀ATGTTCGACAAAGAGTGAAATCTCCTCTA肖LTAGGTTTGCGTCCTCGAGpjrAGAGGTTACAGGArAACCGA黑体为．砌D，酶切位点√蜩陌GTACTGAGAGTGCACCATl、AGGGTTGGA：rCATTCAGTAGC黑体为载体同源序列TTC眦CGACAATATGTCCAGAAATGTGACACCGTCCCTGA黑体为载体同源序列CTCGAGATGAGTTCTAGTGTTGTTGGTGC黑体为勋D』酶切位点GTCGACTCAACATCCTAATTTCTTGTTAC黑体为删，酶切位点AGTCAAAAGCGACGCCAL久12 万方数据pichia·-GSH1·-FP27，pichia-·GSHl··RP28，pichia--GSH2-—FP29，pichia--GSH2··RP30，rGSHl．FP31，rGSHl．RP32，rGSH2．FP33，rGSH2．RP34，rsGEX．FP35，rsGEX．RTGCGGTAGAGGGTArTTCTTCGCCCACCAGCCTCAAAGCAAACCCAGCAGCAACACCTGArGAAGGTp汀CGAGCAGTTACArCGTTAGCCTCACAAAGTGGGCTp汀CACTAp汀GGArTArCAGGTTGGGCCAT芦JCTTGAACCATCATTCAATCACAGGCGTGAGGCGTACTGGTAAAACATTC2．1．4培养条件2．1．4．1大肠杆菌培养条件LB培养基：蛋白胨l％，氯化钠l％，酵母提取物o．5％，固体培养基添加1．5-2％琼脂．培养条件：37"C，2209，培养10-14h。抗生素使用浓度：氨苄青霉素(Amp)lOOng／L，zeocin25ng／L。2．1．4．2毕赤酵母培养条件YPD培养基：peptone2％，葡萄糖2％，酵母提取物1％，固体培养基添加1．5-2％琼脂；YPDS培养基再添加IM山梨醇。MD培养基：O．34％YNB，2％葡萄糖，O．5％硫酸铵，固体培养基添加1．5-2％琼脂；缺陷培养基视情况添加氨基酸混合物。100x氨基酸用量表1氨基酸浓度L．VhlineL．AdeninehemisulfafesaltL．IsoleucineL·ArgmeHCI1500mg／100ml200mg／l00ml200mg／100ml200mg／100ml13 万方数据L—LysineHCIL-MethionineL-phenylalanineL．ThreonineL—Tyrosine300mg／1OOml200rag／100ml500mg／100ml2000mg／100ml200mg／100ml100×氨基酸用量表2(视情况添加)氨基酸浓度L．UraciIL—TryptophanL-HistidineHCImonohydrateL．Leucine200mg／100ml200mg／100ml200mg／100ml1000mg／100ml培养条件：30"C，抗生素使用条件：2009，培养20～24h。zeocin1OOn#L2．1．5酶及生化试剂试剂厂家rTaq，限制性内切酶，M—MLV反转录酶TakaraSYBRPremixExTaqT4DNA连接酶ThermoKOD-plus-neoToyobo胶回收试剂盒Axygen质粒小提试剂盒北京庄盟生物GBclonart无缝克隆试剂盒上海诺晶生物RNA提取试剂盒(E．z．N．A)OmegaZeocinInvitrogenYNB：1．79／L，不含氨基酸及硫酸铵北京鼎国昌盛有限公司Peptone生工生物Yeastextract北京拜尔迪14 万方数据山梨醇l一庚烷磺酸钠氨基酸北京鼎国昌盛有限公司阿拉丁北京鼎国昌盛及生工生物2．1．6常用试剂配制(1)酵母细胞裂解液：lmL裂解液，含868止Triton溶液(8489LddH20：209LTrkonX-100)，100止10％SDS，209L5MNaCl，10此1MTrispH=8．0，2止0．5MEDl’A(2)LDST溶液：100mMLiAc，10mMDTT，O．6Msorbitol，10mMTris．HCI，pH27．52．2实验方法2．2．1PCR程序(1)rTaq酶扩增10xPCRBu仃erdNTPs(10mMeach)Primers(10mMeach)TemplaterTaq(5U／gL)2uL0．49L0．5+0．5止≈1儿0．2：uLH20Upto20也注：模板浓度不宜太高，一般情况下，基因组DNA添加200ng／509L左右，质粒DNA添加50ng／509L左右。反应条件95℃5min95℃30s、50-55"C308}30q5cydes72℃lkb／mm。72℃10min 万方数据16℃oO(2)KOD高保真酶扩增lOxPCRBu行'erdNTPs(2mMeach)MgS04(25mM)Primers(10mMeacmTemplateKOD-Plus—neo(IU／gL)5此5皿3儿0．5+0．5uL=l止19LH20Upto50uL注：模板浓度不宜太高，一般情况下，基因组DNA添加200ng／50肛L左右，质粒DNA添加50ng／509L左右；M92+浓度一般使用t．5mM，当扩增效率不高时，将M92+浓度提高至2mM，可以增加扩增效率。反应条件94℃2min98℃10s50-55℃30s68℃2kb／mirI10min01330-35cycles2．2．2质粒抽提、酶切、电泳、胶回收、DNA片段连接质粒抽提步骤参照北京庄盟生物的质粒小提试剂金说明书；酶切步骤参照Takara或Thermo的内切酶说明书；无缝克隆连接步骤参照GBclonaa说明书；电泳一般使用l％琼脂糖凝胶，电压100-140V，时间15-30mm；胶回收步骤参照Axygen胶回收试剂盒说明书。DNA片段连接体系连接载体0．2111连接片段0．611110xBuffer1ul16、●●>j 万方数据T4DNAligaselglH20upto109l16"C连接3～5h，然后转化大肠杆菌感受态细胞。2．2．2大肠杆菌感受态细胞制备(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)由低温冰箱保存的TGl菌种在固体LB平板上划线，37"C培养过夜；挑取单克隆并接种于5mLLB试管中，37。C培养过夜；取lmL菌液接种于100mLLB培养基中，3TC培养至OD600为o．5左右(约3小时)；冰浴10min，以50mL离心管收集菌体，4'C，4000xg离心10min；弃上清，加入5mL预冷的新鲜配制0．1mol／LCaCl2溶液，以枪头吹吸使菌体悬浮，继续加入35mLCaCl2溶液；冰浴50min，4"C，4000xg离心10min，弃上清；用2mL含20％甘油的0．1mol／LCaCl2溶液重悬菌体；分装为50止每管，于．80"C冷冻保存。2．2．3大肠杆菌转化(1)将5pl连接产物加入50pl的感受态细胞中；(2)冰浴15min；(3)42"C热激90s，冰浴2-3min；(4)加入lmL不含任何抗生素的LB液体培养基，37。C，200rpm培养lh；(5)离心去除部分上清，将剩余菌液均匀涂布于相应抗性的LB板上，3TC培养10．14小时。2．2．4毕赤酵母电转化感受态的制备(2)于YPD平板上挑取单克隆菌落，接种于5mLYPD试管中，30"C培养24h；转接菌液于50mLYPD中，30"C培养至OD600为1．5～2．o；17 万方数据逝堑盔堂亟±堂鱼迨塞差!童(3)(4)(5)(6)(7)(8)10mL每管收集菌液，3000xg，离心3min；弃上清，每管加入约8mlLDST溶液，30"C静置30min；3000xg，离心3min，弃上清；立即加入1．5ml预冷的1M山梨醇，转移菌体于2ml离心管中，4。C，3000xg离心3min；以1．5ml预冷的IM山梨醇洗涤三次；以809l预冷的1M山梨醇的重悬菡体。2．2．5毕赤酵母电转化(1)(2)(3)(4)(5)(6)准备2mmBTX电击杯，冰浴预冷；取lortLDNA片段或线性化质粒，-9毕赤酵母感受态细胞混合，冰浴5min；1500V，20012，25心电击；立即加入lml预冷的1M山梨醇；30℃静置1．5h；分成1009l每份涂板。30。C培养2～3d。2．2．6酵母基因组抽提(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)5mlYPD试管培养待测菌株；收集1ml菌液，离心去上清；加入2001^1裂解液，2009l酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，及50mg细玻璃珠；涡旋1-2min，加入2009lTEBuffer；离心取上清，加入4倍体积的乙醇及1／10体积的3M醋酸钠；12000×g，离心10min，去上清；以70％乙醇洗涤；晾干后加入200ktl水溶解。18 万方数据逝堑太堂亟±堂鱼监塞差2重2．2．7酵母总RNA提取总RNA的提取参照Omega公司的E．Z．N．A试剂盒说明书。2．2．8荧光定量PCR2．2．8．1总RNA消解TotaIRNAl0xButierDNaseI(5U／91)RNaseInhibitorRNasefreeHzO37℃温育20～30min。酚／氯仿抽提：20-50btg5t．tl2ul20Unitsupto509l(1)加入509lRNasefreeH20稀释至1009l；(2)加入等量苯酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)，混匀；(3)室温，12000xg离心5min，去上清；(4)以酚／氯仿再行抽提一次；(5)加入109l醋酸钠和2509l预冷的无水乙醇，．80℃放置20min；(6)4。C，12000“g离心10min，弃上清；(7)加入预冷的70％乙醇洗涤；(8)46C，12000xg离心10min，弃上清；(9)干燥，复溶。使用actin内部引物验证消解结果。PCR循环数40个。2．2．8．2反转录总RNA2-499RandomPrimers(1009M)1．59lRNasefreeH20upto109l70。C温育10min；立即冰浴2min以上。上述变性溶液10I．tl1q 万方数据5xM．MLVBu丘．er4uldNTP(10mM)4txlRTaseM—MLV(200U／lal)0．5“lRNaseInhib“or(40U／斗1)1．5plRNasefreeH20upto20I_tl反应程序30℃10min；42℃60min；70℃15min；冰浴10～15min。9550薯"C30s)40cycles7220sL℃J，95℃15sI嚣间摭mL95℃15s2．2．9谷胱甘肽的提取7．59lO．3pl+O．31al1．2ulupto151xl(1)收集2ml菌液，3000xg离心3min，去上清；(2)水洗两次； 万方数据(3)以40％乙醇提取GSH，置于30"C摇床，2小时；(4)3000×g离心3min，取上清。2．2．10发酵罐发酵(1)①发酵培养基：PeptoneYeastextractGlucoseMgS04‘7H20CaCbKH2P04K2S04209／L109／L59／L0．389／L49／L18．29／L总体积lLQPTMl微量元素(每L发酵培养基添加4．35mL)：CuS04‘5H206．09Nal0．089MgS04‘H203．09钼酸钠·2H200．29硼酸0．029COCl2O．59ZnCl220．09FeS04+7H：O65．09生物素0．29硫酸5．0mL总体积lL(2)流加培养基：6009／L葡萄糖，每L含12mlPTMl微量元素。(3)发酵总体积8L；接种量5％，种子OD2-6；温度30"C，pH=5．5，以氨水调节pH。21 万方数据堑i哒芏亟±堂鱼迨塞差!童2．2．11HPLC测定谷胱甘肽(2)氧化型谷胱甘肽(GSSG)的还原：100I_tl样品+1009l0．25MDTT+509l0．1MTris—HCl(pH=8．5)，4。C静置30min；HPLC条件：A相：50mM磷酸二氢钠+10mM庚烷磺酸钠(pH=2．8)B相：乙腈A：B=95：5流速-1ml／minColumn：C18检测波长：210nm进样量：20止 万方数据浙江大学硕士学位论文第3章第3章谷胱甘肽高产工程茵的构建转运蛋白生物信息学分析对毕赤酵母和酿酒酵母中的Gshlp和Gsh2p进行同源比对，发现它们高度同源，其蛋白序列一致性均超过70％(图3．1及3．2)。这说明酿酒酵母中的Gshlp和Gsh2p在毕赤酵母中可能行使相似功能。cargrgguglyguuuphefthrt：ggargr91ygphefuggtrPwcguargrca：hishccaprptrpwargrcauhishcccprpuactyryaacasnnsTuu-oalvu：cc。vs⋯cleulucc螂㈨!vugucys∽91euiu。gs⋯⋯删cysuul!uHPlCHI翟蓉濯重耄蘧：；：器量翔霉遥漓：灞髓圈蘧蘧⋯⋯⋯⋯⋯iL“q⋯⋯⋯=sgs’】c一：r】⋯g一皿口一qw=州5y∽川ca琳_L_n‰⋯K㈣oK-tw9削67T州㈣：黧罐蠢鼍：嚣￡善：逼羞薏翔疆霉i蠹要冀墨：i鼍：薏；番{美篆：蠹；÷。。；。。函。。i毒；懑目^P+⋯d—d^·二ad—adek黜⋯Ys：一?ommtpa=rydjosg—y=3w!nmd’、一⋯，i：i恤⋯csk^i一■⋯⋯—一‘i：：匿：薏：鬻；黼；芸：舞逼亳；强髓藩薏孽疆礓凛；逗；凛窭，1；溜躔嚣a隅篡耄莲蓬f?rmgcdd：二：⋯iojck⋯aks一：Lpde二ITLz二vr=～锄搿=r÷：o。Ⅲn．F：二Fa：atpeo。dlopt一一fd=o．：ipecaeag”eaal：oo：二匿鼍圜l砻嚣j陋：篡霉匿缱滢墨穗ij蟹酗藩圜冒圈圈雹圈萎j豳蓬：赢j潞驾避I。EG“。。PF⋯o：grricsc丘：：qapc二F。：aryl?oⅢ：apla·aasaaapa5kgfia。q刚?t二5j⋯a：tpkergvapiipkynghgaggiai：oekoJ．豇舞霎害。潮嚣；习鐾：蔼震嚣芝麓嚣矗，童；薹雷l疆蟹：臻莲∑薏黑濯圜鹭圈匿m1Pksrydsvdltljop：o’：：：ee$y吼dsⅢ蛳。0“endF．apfdsdLahhfahlf一Ⅲ二：÷÷二lnqonkkendnfeni口stnwqt二rfk圜薯懑墨凋鹱溢寓圈匿墨≥翼酎：基二障麓：舞凑；墨耄翟置裟；；5潮一AIIK。E!L孺．pFtq二a：pdkkdqFg⋯eiop：elom：⋯oysvfIt二一也二frdn．nay—msk⋯㈨a九n㈨dafdr,fn!kknfesncsdae】edlsl墨墓誉嚆鬟：品舅：善：姜强萎震黑：蛩琵凄赐理童；毒蘑j濯毫耗：舞搠疆豢a嚣詈：灌：K8二￡ngp8d：291：o』I九Kalocqkg：05ka二’-se二etdhaheK—kvylkf+od⋯oe：pstak：：rdfvikhDdykhdsnsdsinydllekcdklth罨。墓灞稍L。。THD。LE。AFZ。FI。．．．。．id“kdeiaeffgaeiaedl。a!K：二m-：图3．1毕赤酵母和酿酒酵母中Gshlp的同源比对 万方数据dskrstrnglyacidicⅫinaeidsdehydrphbicⅫina=idsailfwv口1一⋯c】dmncqstyislectzi．--pintchargeatphttalnumberfbases％ranslatedisag：cambig⋯atcgb⋯⋯ta。gtd⋯5btstelnrthmelting％emp—llacetempccdnusageg⋯；⋯u；-jj⋯一一⋯o；一=；一，；⋯二‘ig—wo；⋯⋯a=r一一⋯：一一g⋯⋯r⋯：rpua㈣yr⋯⋯ih二shccgPzpuau+j’：j⋯⋯⋯a⋯⋯“p=Ptyrya⋯⋯二lE—p二og⋯a二vi⋯zpa⋯i1P⋯⋯r5}一a1⋯⋯spc]．e⋯一r59ug-．-a：。一一a一一⋯=5j⋯a：，。；：：?5⋯：ieu!一⋯⋯二～⋯s：cm=g一一；⋯⋯n。Js一。：r一量萤冒萝量曩凳墨重霉露冒誉匿；嚣逼酝墨凳三：。。呙：：二蛀。。：。晶釜j品÷翟耄；蒙。晶。ii菇÷，?。莲：薯匿要黑i一⋯⋯一tdl(⋯·’’q⋯⋯一rg二’·⋯⋯一⋯⋯一⋯一⋯口e，⋯⋯ttn。q⋯⋯dhy⋯Kd；一⋯⋯_匿；舞懑；滢：，塞凳震；薏惹薯：剿；灞匿：蔷。。馒纛墨鏊墨i壹圈；璃譬霪蒜违k一1gng．fimFTp‘：eeh}⋯c川c、叫tP：o：⋯：=dea．⋯eo!ne：?一⋯8q。⋯一．一⋯一!drdf+j一-一一：‘⋯：K-．+∈．≈’一_=。嚣墨墨l黼。TLSA。PS[DGIN?G：疆明圈圈睡墓凛翟：；谭薹墨：譬穗：嚣墨重：遣：墨塞磊塞；rj：igi!=sd二!一dk，=i：aFsf。g⋯⋯-i⋯f⋯vs：591se’v—q⋯j’一39kydneg-=二^feCoelD—sdsg、i·adaldk⋯5yk⋯⋯黧盛濡谭圈匿馐灞嚣姜莲溷：雾篙薏穗：嚣罐霪遵翟津灌；笔蘧浯雾：舞；⋯o?⋯!：oqnne⋯f一：a—e!e1一fg⋯二=：⋯f．1aK—od‘：7一f，-j⋯⋯、．?二⋯．⋯一fe，⋯a：⋯1Ks‘a⋯l；霉圜馑懑退譬萎薹器要：薯。翘i舞薯錾；警凑墨薹墨i潮嚣霾匿羹穗圈：蔼墓麓疆要T'j：!tq．!。cKk．0=一⋯a—a’：：⋯aedkdl⋯c黜fv：一)。一5ejgqeakE．afeepekfvlkpqre⋯一yker,1p^fiL．a一⋯。3圈豳童；譬基罐老i蘧墨墨瑁匿；莲；谨匿薹5馐毫匿瑁l毒量暖需豳墓{图3．2毕赤酵母和酿酒酵母中Gsh2p的同源比对通过DNA序列BLAST找到酿酒酵母中OPTl在毕赤酵母中的同源基因。其蛋白序列一致性约为60％(图3．1)。后续实验以该同源蛋白为对象进行基因除。嚣妻：；一耋篡童。：。匿鬻怠冀：墨麓：凳鬻，：￡蘧懑瑟懑篡羔焉：鬻；鬈：三姜：鬈；嚣；。：翟主翼薏譬嚣豳l霞麓羔暑；；=。一二sjs⋯一⋯二5：㈣eFs：．ca一眦一7⋯el_Ko‘：i_：c一⋯⋯pa=⋯一r口e-‘==一s一二：-：一e；=一5一一⋯、⋯1-【⋯o⋯ON'-!，F：要篡_：。匿：凋麓雹圈圈圈圜强圈基壹隧：星“舞慧冀，耆禽懿墓硼灞霉圈寝：萎Co⋯⋯!p：-j．rthwr：wi一：：．：～!州na：：5一=，Ps。9Ⅲf⋯way?a；kf·az—ipd—k：Kkspf：：⋯；c二：一H⋯～：⋯^一：蚍a7amn～嚣薯篆曼⋯：。蓉重黧i懑霉篓匿墨浔酝鬈嚣凛豳奎萋意罐誉妻蠢：墓寝鬈墓匿溜霪誊：。!⋯⋯．a00n：!出d：gagYq：．．Vw：50c．=y㈨ae⋯：一；⋯a”；o：一一：一。s=K—e’：a、a7g⋯o：yr：二·aY：一：2w∑-wfP7二·ft=：；i；：；‘童麓．F。rc⋯，嚣Z墓；薏濯：j澄蘧墨：凋圜疆蕊聋圜霭；溜l翔；糟j肇匿锻3”9÷8Cc⋯⋯5．E、：n：．1waP‘：=聃二·d?：一：o：⋯：自⋯·：：o、：o·s⋯59s、：。耳：-、s批y⋯=一=：一二一P：一)r：删oa?：?一pv⋯s_二=o_|=：nK⋯09tioFp：⋯cn：⋯a．prc⋯，圈鐾塞耋：鎏冒昧圈豳圈霹i魏；霉匿糊鬈漶捌要潞潮圈￡豁蠢翅善。494Co⋯⋯!ynvtk．．ncc：一一c—ekVK‘J’⋯：·c二s、一jaLnfaaY·a·二眦c2yr,gKⅢBKfkoaknqgEo^眦l眦nyKoapawy,L·』：⋯⋯gf、⋯O‘tl；F：要鬟⋯，：蓉鐾嚣感凋瀣善圆圈霉慝羞懿懿圈圈；圈墨瀚鼍辩蕊i；；￡⋯⋯os⋯：二dt0二⋯E：m⋯s．in-"一F：；一a一：二q二1；一．：÷出gj_一x成—．：1+YgfⅢ{；．e．s：c．，：瑚j⋯ko：：二!amqlwO。ptl≤Fp。：c⋯r．s。．。Frc。一浯墨耀韵鎏莉喜嬉墨嚣凛圈暖塞譬莲羞E墨薹鬈：愚害；麓蒜霹。693c⋯⋯osa：．』agivnvg㈣qen—a：1c．toqpa9：二cangrtlfnas一二⋯Pk!一f5Pgq二yna二mw：f．二jaf8；：atya．hKKfphfk!akhlnap＼fft。OF嘶t!。：；‘耋麓纛⋯，。圜：通津；l蘧灌穗埔圈墨懑；霉舞震礓鄹嘉誊'。EGT霜：霜露薏菘Cc一⋯sgFgnlfp5tpyn}5。：：⋯一i一}：⋯aw：ok?n：jnj⋯ea∥a⋯··二一{：PPq’：⋯g⋯e：』。n。gkkfy：l⋯e⋯fgpd图3．3毕赤酵母中和酿酒酵母Optlp的蛋白序列比对 万方数据而针对酿酒酵母中GF强11基因，其在毕赤酵母中所对应的同源蛋白序列一致性仅为34％(图3．4)，所以并不能确定该同源蛋白就是GSH的转运蛋白，还需直接实验结果证明。Ge：：icp二。拍眦M黯Ews啪ss∞p嘲NETn琶c诅{；KmF哺s逼s瘴：眦艇E盱Y咖通V¨蠼Y遇?¨Y、ⅣFFis：岳LvAY^Y蜊霉t蠼j。。冀：．_；Eerevl51a!．Dr2MSSSl＼：K鹰Hx毒：Bosc!：奄i已臣髂IDr：Ys咿：?FF吐叠!逼_：礓E豇K!I：u!：：堵V：：奠!sE馐蝎蘧：?露}一：：is÷i!j!mso．es：sC：gSs_-1PFS’,C,ejSST．k35：／kLsfeiieoerhnnsjifnlee誓：；：i∈一e二．jj；：：s+·0+ifffsaficafa二童loa