毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究

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1、中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所博士后士学位论文毕赤氏甲醇酵母谷胱甘肽代谢工程的研究姓名：王绍校申请学位级别：博士后士专业：生物技术指导教师：张世明;吴祥甫20050401摘要根据不同来源的Y一谷氨酰半胱氨酸连接酶基因的同源性比较，采用RT—PCR和RACE技术，从毕赤氏甲醇酵母GSll5中克隆了编码Y一谷氨酰半胱氨酸连接酶的eDNA序列。它的全长是1974bp，编码一个含有658个氨基酸的多肽，该多肽的计算分子量是78．3kDa。它的推导氨基酸序列与已知的来源于酵母、小鼠和人的Y一谷氨酰半胱氨酸连接酶的氨基酸序列有较高的相似性。在毕赤氏甲醇酵母G

2、Sll5中敲除该基因，使GSll5成为谷胱甘肽自养型菌株。在毕赤氏甲醇酵母GSll5中加强该基因的表达，可以使细胞内谷胱甘肽含量的增加。重组菌株G8在甲醇诱导过程中，胞内谷胱甘肽含量为83mg／gprotein，为目前报道的胱甘肽含量最高的酵母菌株之一。根据不同来源的甲硫氨酸合成酶基因保守序列，从毕赤氏甲醇酵母GSll5中克隆了该基因的一段保守序列，应用RACE技术进一步克隆了两端序列，得到的该基因的全序列，其推导的多肽含有768个氨基酸残基，分子量为86kDa。与酿酒酵母的甲硫氨酸合成酶基因有76％的同一性。甲硫氨酸合成酶由两个结构域组成，活性位点在C端的结构域中。C

3、端结构域参与酶和底物Hcy／Met、C也一H{PteGlu。(n≥3)的结合。功能互补试验表明：在酿酒酵母甲硫氨酸合成酶缺陷型菌株中引入该基因，可以使该菌株在基本培养基中恢复生长。关键词：y一谷氨酰半胱氨酸连接酶；甲硫氨酸合成酶：RACE；基因敲除；毕赤氏甲醇酵母AbstractBasedonthehomologyof7-glutamyl—cysteineligase(GeL)genesfromdifferentsources，aeDNAsequenceencodingJr—glutamyl-cysteineligasewasisolatedfromPichiapast

4、orisbyusingR■PCRand5'-／3。RACEextension．Thefull—lengthgeneisl974bpthatencodesapolypeptideof658residueswithacalculatedmolecularmassof78．3kDa．ThededucedaminoacidsequenceOfPpG(ZshOWShighsimilaritytothoseofG@sfromyeasts．ratandhuman．ThesequencewassubmiRedtotheGenBankdatabaseunderaccessionNo．AY

5、445649．DisruptionofGC￡geneinPpastorisGS115resultedincompleteglutathione(GSH)auxotrophy．EnhancingexpressionofPpGCLin上pastorisGSl5increasedGSHaccumulationinthecells．Inonerecombinantstrain．G8，theGSHcontentreached83mg／gproteinduringmethanolinduction，whichiSoneofthehig】1estyieldsofGSHinyeasts

6、thathavebeenreported．MethionineSynthaseiSanimportantenzymeinthepathwayofmethioninemetabolism．BasedontheconservedregionofMSsequencesfromdifirerentspecies．theconservedfragmentofMSgeneWasclonedfrom尸ichiapastorisgenomicDNAbvPCR．Theremained5’and3’regionswerefurtherclonedbv5’RACEand3’RACE．resp

7、ectively．TheassembledMSgeneofPichiapastorisencodesapolypeptideof768residueswithmolecularweightof86KD．whichshares76％identi打丽mMSofScerevisiae．TheresultofconserveddomaindatabaseblastindicatedthatPichiapastorisMSisbuiItbytwodomainsandtheactivesiteis10CatedattheC-terminaldomai