重组巴斯德毕赤酵母pichia+pastoris生产还原型谷胱甘肽条件及其分离纯化的研究

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1、新疆农业大学硕士学位论文重组巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）生产还原型谷胱甘肽条件及其分离纯化的研究姓名：王晓菊申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：王纯利20090601重组巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)生产还原型谷胱甘肽条件及其分离纯化的研究摘要丫-L一谷氨酰·L·半胱氨酰甘氨酸(丫一L-eysteinglycine，glutathione，简称GSH)是重要的三肽化合物，其主要工业生产途径是通过微生物发酵进而提取，并被广泛用于临床疾病的治疗和其他方面。国内外关于GS

2、H的生产及其应用已经有了一定的研究，但其工业化生产技术一直被国外极少数发达国家垄断着，国内自发研制的GSH产量和纯度都相对较低，还尚未实现工业化生产，从而造成GSH的市场价格居高不下，影响了GSH的推广和应用。本文通过大量的试验研究，采取以下途径实现了GSH的高产和高纯度，为实现GSH的国内工业化生产提供理论参考。首先，本文通过研究酵母细胞中含硫物质的代谢过程，改造了其代谢途径。确定了适宜的培养基：209／L甘油，109rL酵母膏，209a．，蛋白胨，0．05mol／L磷酸盐缓冲液，13．49／LYNB，

3、4x104e,／L生物素，O．05mol／LL—cys；确定了客观培养条件：温度为28"(2．30‘C、溶氧充分、初始pH为6．O；在此基础上，经过5天的发酵，GSH产量可达到6．09／L，实现了GSH的高产量。然后，根据GSH主要分布在微生物细胞胞内，并可通过温度或有机物改变细胞膜的通透性或破坏细胞壁将其释放出来的特点，并利用GSH等电点在5．93左右，使其在酸性条件下带正电荷，这样GSH将与阳离子树脂进行离子交换而被树脂吸附，从而将GSH与其他杂质分离。此外，为了获得更精制的产品，本实验还把超滤、纳滤

4、等技术引入到分离纯化工艺中，使GSH的收率达到了90％，纯度也达到了95％，实现了GSH的高纯度。综上所述，GSH的分离纯化工艺较为复杂，且当发酵中GSH产量低于一定值时，其纯化工艺就难以进行。本实验通过上述方法实现了从高产的Pichiapastoris中提纯GSH，并简化了GSH的纯化步骤，解决了GSH工业化生产存在的难题。关键词：谷胱甘肽；重组子：发酵；分离纯化；PichiapastorisStudyonFermentationConditionsofRecombinantPichiapastoria

5、ndSeparationndPurificationofGSHpastortsannricationelAbstractTheglutathioneisanimportanttripeptidebroadlyappliedforthetherapyofmanydiseasesinclinic．FermentationofmicroorganismandextractingGSHfromthecellisthemainindustrialproductionprocess．Thestudyofproduct

6、ionandapplicationaboutGSHisalreadyquitematureathomeandabroad，however,theindustrializedproductiontechnologyisstillmonopolizedbyafewothercountries．ThedomesticyieldandpurityofGSHarerelativelylow,andtheproductionisstillnotreachedrealizedindustrializedproducti

7、on,whichresultsthepriceofGSHveryhighandconstrainsitsapplicationatlarge．Inthisstudy,thefollowingapproacheswereadoptedduringtheexperimentsforrealizinghi曲yieldandpurityofGSHandprovidingtheoryofreferenceforindustrialproductioninChina．Firstly,themetabolicproce

8、ssofsulfurcontainingmaterialinthecellofPichiapastoriswasexplored，anditsmetabolicpathwasthenmodifiedrationally．TheoptimalmediumforGSHfermentationwasscreenedas209／Lglycerol，20e,／Lpeptone，109／Lyeastextract,0．05mol／Lpho