毕赤酵母谷胱甘肽高产工程菌的构建

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1、万方数据分类号：密级：中文论文题目：洳≥：j、嘧硕士学位论文⑧单位代码：!Q三三5学号：21lQ2Q鱼2英文论文题目．一ConstructionofEngineeringPichiapastoris．．StrainsforHighGlutathio—n—e—P———r——o———d———u———c———t——i—o———n—．万方数据JlUllIIIllllllllllIIIIIIIY2665815ADissertationsubmittedtoZhejiangUniversityinpartialfulfillmentofthe

2、requirementsforthedegreeofMasterofScienceGlutathioneProductionCandidate：Jian．BoLiuSupervisor：Yong一-QuanLi,ProfessorCo-advisor：Wen-JunGuan,Profess—o—rSubjectCollegeBiochemistryandMolecularBiology_．CollegeofLifeSciencesSubmittedDateJune，2014⑧万方数据论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4．评阅

3、人5：答辩委员会主席：——(姓垒＼职称＼望鱼)委员1：委员2：委员3：委员4．委员5：万方数据英文论文题目：一ConstructionofEngineeringPichiapastoris—StrainsforHighGlutathioneProduction⑧Author：Jian—BoLiuSupervisor：至ro坠g：Q丛垒塾坠iExternalReviewers：(姓垒3壁整3望焦，王回)ExaminingCommitteeChairpersonExaminingCommitteeMembers：Dateoforald

4、efence：June7恤，2014万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：扫翰7噻／签字日期：驯严年石月z歹日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，

5、允许论文被查阅和借阅。本人授杈堑姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：否协办钨签字日期：酬降6月哆导师签名签字日期：年月日万方数据浙江大学硕士学位论文摘要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合成的三肽，是细胞或组织内存在的重要的非蛋白类含硫物质。它具有非常重要的生理功能和临床应用价值。目前GSH最主要的生产方法是微生物发酵法，选用的菌株多为酵母。在传统的诱变育种之后，基因工程定向改造

6、方法使用越来越广泛。毕赤酵母是使用非常广泛的真核蛋白表达体系，它作为表达宿主具有很多优势，如具有严密调控的高效启动子，可以高密度发酵，外源蛋白不会过度糖基化等。本论文通过在毕赤酵母中以GAP启动子高效表达来自酿酒酵母的GSH合成酶基因sGSHl和sGSH2，构建毕赤酵母谷胱甘肽高产工程菌。因胞内GSH的过量积累会造成GSH合成酶Gshlp受到反馈抑制，从而导致酶活性减低，不能有效提高谷胱甘肽的产量。基于此，本论文在已有的酿酒酵母谷胱甘肽转运体系研究的基础上，改造了毕赤酵母的谷胱甘肽转运蛋白，以促使胞内积累GSH的外排，减小Gshl

7、P受到的反馈抑制，最终达到提高GSH总产量的目的。本论文构建了一个多基因改造的工程菌株JC312(口叫，sGSHJ，sGSH2，opt]，sGEXl)，即在毕赤酵母JC308(adel，d叫，his4，ura3)ee表达了GSH合成酶基因sGSHl和sGSH2，同时敲除吸收转运子OPTI，并过表达外排来源于酿酒酵母的转运子sGEXl。通过此一系列的改造，GSH的摇瓶产量相对于初始菌株提高了90％，8L发酵罐发酵后产量在摇瓶发酵基础上又提高了一倍，达到173mg／L。关键词：谷胱甘肽，毕赤酵母，GAP启动子，转运子，高产工程茵万方数

8、据浙江大学硕士学位论文AbstractGlutathione(GSH)，iscomprisedofL·glutamicacid，L-cysteineandglycine．GSHisthemostabundantnon—proteinthiolcom