水杨酸合成酶AmS的异源表达、纯化以及生化性质鉴定

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1、单位代码10006学号101010131分类号Q256毕业设计(论文)水杨酸合成酶AmS的异源表达、纯化以及生化性质鉴定学院名称生物与医学工程学院专业名称生物工程学生姓名代盛旺指导教师张立新郑丽沙2014年6月水杨酸合成酶AmS的异源表达、纯化以及生化性质鉴定代盛旺北京航空航天大学本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：代盛旺签字：时间：2014年6月北京航空航天大学本科毕业设计（论文）任务书Ⅰ、毕业设计（论文）题目：水杨酸合成酶AmS的异源表达、纯

2、化以及生化性质鉴定Ⅱ、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：在实验的前期，张立新研究员实验室博士生谢峰利用genomemining从嗜甲基拟无枝酸菌Amycolatopsismethanolica中获得了非核糖体肽类铁螯合剂amychelin及其类似物，它的结构中也存在这一个水杨酸单元。通过对它的生物合成基因簇进行分析，发现其中amS基因可能编码水杨酸合成酶其和已知的Irp9，MbtI等相比，序列具有较低相似性（与Irp9相似度为40%，与MbtⅠ相似度为46%），这预示着其中可能有新的生化特性。作为该类酶的一个新

3、成员，对它的生化特性进行研究有助于我们对水杨酸合成酶的生化特性和作用机制的进一步了解，有利于我们设计活性更好的针对这一靶点的药物，造福于人类。本实验需要良好的分子生物学和生化知识基础，较为熟练的实验动手能力。Ⅲ、毕业设计（论文）工作内容：基因克隆（包括amS基因PCR；连接产物到T载体，转化大肠杆菌；挑单克隆，提取质粒，对质粒上连接的基因测序；获得正确基因，连接表达载体；表达载体检测）；异源表达（包括转化表达载体到表达宿主当中；用不同浓度的IPTG进行不同温度诱导；破碎菌体，提取可溶性目的蛋白，对目的蛋白纯化，脱盐，检测蛋白浓度）

4、；体外生化实验（找到其最佳反应条件；检测蛋白生化性质；检测其酶学动力学常数）。　　　　　　　　　　　　Ⅳ、主要参考资料：(1)RatledgeC(2004)Iron,mycobacteriaandtuberculosis.Tuberculosis84:110–130(2)SchaibleUEKS(2004)Ironandmicrobialinfection.NatRevMicrobiol2(12):946-953(3)SkaarE(2010)Thebattleforironbetweenbacterialpathogensandt

5、heirvertebratehosts.PLoSPathog6(8):e1000949(4)LawlorMSOcC,MillerVL(2007)YersiniabactinisavirulencefactorforKlebsiellapneumoniaeduringpulmonaryinfection.InfectImmun75(3):1463-1472(5)Manos-TurveyABE,RutledgePJ,BakerEN,LottJS,PayneRJ.(2010)InhibitionStudiesofMycobacteriu

6、mtuberculosisSalicylateSynthase(MbtI).ChemMedChem5(7):1067–1079(6)RatledgeCDL(2000)Ironmetabolisminpathogenicbacteria.AnnuRevMicrobiol54:881-941(7)DeVossJJRK,SchroederBG,SuH,ZhuY,BarryCE3rd(2000)Thesalicylate-derivedmycobactinsiderophoresofMycobacteriumtuberculosisare

7、essentialforgrowthinmacrophages.ProcNatlAcadSciUSA97(3):1252-1257(8)GailleCKP,HaasD(2002)SalicylatebiosynthesisinPseudomonasaeruginosa.PurificationandcharacterizationofPchB,anovelbifunctionalenzymedisplayingisochorismatepyruvate-lyaseandchorismatemutaseactivities.JBio

8、lChem277(24):21768-21775(9)GailleCRC,HaasD(2003)IsochorismateSynthase(PchA),theFirstandRate-limitingEnzymeinSalicylateBiosyn