四川省猪嵴病毒病流行病学调查及间接elisa抗体检测方法的建立

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万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四JII农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：砾蕾阳l牛if-6月f旧关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。。本论文不保密。。本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上。内划“4”)研究生签名：导师签名‘砾蕾妙乡宇文如l牛年6月ff日7，‘中年6月I／日 万方数据中文摘要猪嵴病毒(Porcinekobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)嵴病毒属(Kobuvirus)成员。2008年，匈牙利学者首次报道在无临床症状表现的猪粪便中发现猪嵴病毒；2009年，在中国猪群中也检出了猪嵴病毒。自此之后，多个国家报道在猪群中检测到猪嵴病毒，包括泰国、臼本、韩国、荷兰、巴西、西班牙、意大利、东非等。猪嵴病毒是一种具有传染性、在世界范围内广泛分布的新型病毒，在腹泻猪中有较高检出率，认为可能是猪腹泻的病原，但鉴于其在没有腹泻的猪群中也普遍存在，且目前尚未能实现体外分离培养，需要更多的研究来阐明其生物学特性及病原特性。本研究旨在对四川地区猪嵴病毒病流行情况进行调查，并对四川株猪嵴病毒VPI基因分子流行病学特点进行分析；VP]蛋白是嵴病毒暴露在最外面的结构蛋白，是嵴病毒的优势免疫蛋白，本研究通过大肠杆菌表达系统，表达猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区，利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法，为今后猪嵴病毒血清学诊断方法的研究奠定基础。本研究在2011．2012年从四川猪场中收集了163份猪粪便和肠道组织样品，其中112份来自腹泻猪，51份来自没有腹泻的猪。利用RT-PCR方法对样品进行检测，猪嵴病毒的总阳性率为53．4％(87／163)，腹泻样品中猪嵴病毒总检出率为64．3％(72／112)，采集自无腹泻猪的样品中，猪嵴病毒的感染率为29．4％(15／51)。利用SPSS21．0软件对腹泻组数据和无腹泻组数据进行卡方检验，结果显示猪嵴病毒感染和腹泻具有极显著相关性，2=17．126，P=3．5×10一；在哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和成年母猪中，猪嵴病毒的感染率依次为：66．7％、39．1％、23．5％、40．0％，对四个年龄段感染数据进行卡方检验，分析显示哺乳仔猪和猪嵴病毒感染具有极显著相关性，，=10．941，P=9．4x10卅。腹泻猪和幼龄猪可能对猪嵴病毒更易感。利用RT-PCR扩增猪嵴病毒VPl基因序列，通过分子克隆，测序得到35个猪嵴病毒VPl基因序列(GenBank登录号：KFl57917-KFl57951)，核苷酸序列相似性为80．7％一100％，氮基酸序列相似性为87．2％．100％。利用MEGA5．0软件对猪嵴病毒VPl基因序列进行系统进化分析，结果显示本研究获得的四川株猪嵴病毒分属于四个大的分支，说明多株猪嵴病毒在四川地区流行，进化树显示猪嵴病毒VPl基因序列的分群无明显地域性差异。通过序列分析，表明在两只猪的粪便样品中分别检出3株和2株猪嵴病毒共同感染，首次为多株猪嵴病毒共感染提供了依据；通过重组分析软件㈣荨j『删7～㈣绁脚1～㈣姐 万方数据RDP和Simplot预测，发现3株共感染的猪嵴病毒A1、A2、A3之间存在重组事件，A2序列的VPl区段可能是由于A1和A3之间发生重组产生的。重组事件的发生会推动病毒基因组的进化，导致基因多样性的发生。本研究通过BepiPred、Bcepred、DNAStar中Protean来预测分析猪嵴病毒VPl蛋白线性抗原表位，综合各种预测结果，选择抗原表位较集中、抗原指数较高的前半段(1—462bp)作为猪嵴病毒优势抗原表位区，将选取的基因片段送公司进行密码子优化后合成基因，将合成的基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+)00，构建重组表达质粒pET32一VPl，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达，通过对诱导条件进行优化，确定37。C，0．2mmol／LIPTG诱导表达4h为最佳诱导条件，重组蛋白大小为35．6KDa，以可溶性形式存在，在Westernblot检测中，通过Ni柱纯化的VPl重组蛋白和猪嵴病毒阳性血清存在特异性反应，说明重组蛋白具有良好的抗原性。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原，初步建立猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方法，并对间接ELISA反应的各个条件进行优化，结果显示，抗原的最佳包被浓度为2pedmL，血清最适稀释倍数为1：200，37。C1h+4℃过夜为重组蛋白最适包被条件，5％脱脂奶粉封闭90min为最适封闭液和封闭时间，待检血清温育时间为60min，酶标二抗工作浓度为1：6000，作用时间为60min，TMB底物作用时间为15min，阴阳性临界值为0．250。建立的问接ELISA检测方法具有较好特异性，与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪-2td,病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒6种常见猪病病原阳性血清无交叉反应。建立的方法具有较好的重复性，批内重复性实验和批问重复性实验，变异系数均小于10％。用建立的间接ELISA方法，对170份猪血清样本进行检测，结果显示65份血清为猪嵴病毒抗体阳性，阳性率为38．2％。本研究建立的间接ELISA检测方法，为今后猪嵴病毒血清学诊断方法研究奠定了基础。关键词：猪嵴病毒；VPl基因；腹泻；流行病学调查；抗原表位：原核表达：重组蛋白；问接ELISA 万方数据AbstractEpidemiologicalinvestigationofporcinekobuvirusdiseaseinSichuanProvinceandestablishmentofanindirectELISAmethoddetectingporcinekobuvirusantibodyChenLei(PreventiveVeterinaryMedicine)DirectedbyProfessorXuZhiwenPorcinekobuvirus(PKoV)isthememberofKobuvirusgenus，PicornaviridaefamilyPKoVwasfirstdetectedinaHungaryfarmin2008inapparentlyhealthypigs，thenin2009，itwasalsodetectedinChina．Sincethat，PKoVhasbeendetectedinThailand，Spain，Japan，Korea，theUnitedStates，Brazil，theNetherlands，CzechRepublicandrecentlyinItaly，EastAfrica．PKoVisanemergingviruswidelydistributedworldwidewithhighprevalencerateindiarrheicpigs，itwasthoughttobeapotentialpathogenyofswinediarrhea．ConsideringPKoVwasalsoprevalentinnon-diarrhealswineryandthelackofacellculturesystemtopropagatePKoVinvitro，morefurtherstudywouldbeneededtoclarifythebiologypropertiesandpathogenicityofthisemergingvirusTheaimofthisstudywastodeterminetheprevalenceofPKoVdiseaseinSichuanProvinceChina，andtOanalyzethephylogeneticandgeneticrelationshipsoftheVP1regionbetweenSichuanPKoVandreferencekobuvirusstrains．VP1proteinisthemostexposedstructureproteinofkobuviruses，anditisalsotheirmnunodominantpartofthepicomaviruscapsidprotein．PKoVVPImainantigenicepitoperegionwasexpressedinEscherichiacoliexpressionsystem，purifiedrecombinantproteinwasusedtoestablishanindirectELISAmethodtodetectPKoVantibodyinserumsamples，providingsomereferenceforfurtherserologicaldiagnosisstudyonPKoVAtotalof163porcineintestinalandfecalsampleswerecollectedduring2011-2012，SichuanProvince，China．Thenumberofnon—diarrhealanddiarrhealstoolwas51and12，respectively．Usingprimerstargetingthe3Dregion，53．4％(87／163)pigswerepositiveforPKoV．TheproportionofasymptomaticpigsandthosewithdiarrheathatwerePKoV-positivewere29．4％(15／51)and64．3％(72／112)，respectively．Detectionrateof 万方数据PKoVinsucklingpigs，weanedpigs，growing／finishingpigs，andSOWSwere，66．7％，39．1％，23．5％and40．O％，respectively．PKoVinfectionwassignificantlyassociatedwithdiarrheainpigs(f=I7．126，P=3．5×10．5)usingPearson’Schi—squaretest．Statisticalanalysisshowedthatporcinekobuvirusinfection-stronglycorrelatedwithsucklingpigs，whichwereyoungerthan4weeksold(X2=10．941，P=9．4×10．4)．Theseobservationsimplythatyoungpigsandpigswithdiarrheamightbemoresusceptibletoinfection．RT-PCRwasusedtoamplifyVPIgenesequence．Theobtained35VPlgenesequencesweresubmittedtoGenBank(Accessionnumbers：KFl57917一KFl57951)，theseVPIsequenceswere80．7％-100％similaratthenucleotidelevel、and87．2％一100％similarattheaminoacidlevel．The35VPlgenesequencesbelongedtofourdifferentbranches，indicatingmultiplestrainswerecirculatinginSichuanProvince．TwopigswerefoundtobeCO-infectedwithmultiplestrains．Thisisthefirstreport，withsupportingevidence，ofmultiplestrainsofCO—infectingasinglepig．PossiblerecombinationeventswereanalyzedforsequenceA2byRDPandSimplotsoftware；A2mighthavebeengeneratedfromrecombinationbetweenA1andA3intheVP1region．RecombinationeventshavecontributedtothevirusgenomeevolutionandgeneticdiversitywithinhoststhatweobservedAntigenepitopeofVP1proteinwasanalysedbyusingBepiPred、Bcepred、DNAStarProtean．Throughcomprehensiveconsiderationofallpredictionresults，1-462bpregionofVPIproteinwasselected，whichhadhigherantigenicindex，andthemainepitopesconcentratedinthisregion．SelectedsequencewassenttoGenscriptcompanyforcodonoptimizationandgenesynthesis．ThesyntheticsequencewasclonedtopET32a(+)bydirectedcloning．ConstructedplasmidpET32·VP1wastransferredintoE．coliBL21(DE3)competentcell．Inducedexpressionconditionswereoptimized．Theoptimalinducedexpressionconditionswereasfollows：37。C4h，0．2mmol／LIPTGTherecombinantproteinwas35．6KDaandexistedasinsolubleprotein．TheprokaryoticexpressionproductswerepurifiedbyusingNicolumn．PurifiedrecombinantproteinhadspecificimmunityresponsewithantibodypositiveseruminWesternblotdetection，indicatingthegoodantigenicityofrecombinantproteinPurifiedrecombinantproteinwasusedtoactascoatingantigen，theindirectELISA1V 万方数据detectingPKoVantibodywasestablishedinitially,everystepwasfurtheroptimized．Antigencoatingoptimalconcentrationwas299／mL，andtheoptimalserumdilutionwas1：200．Incubationat37℃lhplus4。Covernightwastheoptimalrecombinantproteinantigencoatingcondition．5％skimmilkpowderwastheidealblockingbuffer,andthedeterminedblockingtimewas90min．Optimalserumreactiontimewas60min．OptimalworkingconcentrationofHRPrabbitanti—pigantibodywas1：6000，optimalreactiontimewas60min．TheoptimalTMBreactiontimewas15min．CutoffvaluefortheindirectELISAwas0．250．TheestablishedindirectELISAhadgoodspecificity,crossreactionswerenotobservedwhenstandardpositiveserumofTGEKPEDV,艘WCSFKPP蟛PRRSVweredetected．170porcineserumsamplesweredetectedwiththeestablishedindirectELISA．65／170(38．2％)werepositiveforPKoVantibody．TheestablishedindirectELISAwouldprovidesomereferenceforfurtherserologicaldiagnosisstudyonPKoVKey-words：porcinekobuvirus，VPlgene，diarrhea，epidemiologicalsurvey，antigenepitope，prokaryoticexpression，recombinantprotein；indirectELISAV 万方数据缩略词表Vl 万方数据目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract．⋯．．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．．．．．⋯．．⋯．⋯．．⋯．．⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．III缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．VI第一部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11嵴病毒的发现及生物学分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12嵴病毒形态学结构和基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23嵴病毒基因组及其编码的蛋白质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34嵴病毒生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45嵴病毒流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45．】人爱知病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45．2牛嵴病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55．3猪嵴病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．56嵴病毒的实验室诊断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7本研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7第二部分实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9第一章2011-2012年四川地区猪群猪嵴病毒感染情况．调查及猪嵴病毒VPl基因分子流行病学调查分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9】材料与试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．1实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．2实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．3溶液及配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4临床样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．5菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一10{ 万方数据2．1引物合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．2样品的处理及总RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．3反转录制备cDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l2．4猪嵴病毒PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．5生物统计学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．6猪嵴病毒VPl基因扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．7目的DNA片段的回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．132．8分子克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132。9猪嵴病毒多聚蛋白基因的基因多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．10序列相似性分析和系统进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．】1重组分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．163．1猪嵴病毒3D基因的RT-PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163．2猪嵴病毒抗原RT-PCR检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．163．3生物统计分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．173．4猪嵴病毒VPl基因扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯183．5猪嵴病毒多聚蛋白基因的基因多样性分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．183．6系统进化树分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．203．7重组分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．20第二章猪嵴病毒VPl基因生物信息学分析与蛋白优势抗原表位区域的原核表达⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：17l材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．271．1实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271。2实验器材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271．4菌种及载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．281．5阳性血清和阴性血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．292．t猪嵴病毒VPl基因生物信息学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292-2猪嵴病毒VPI基因优势抗原表位密码子优化与基因合成⋯⋯⋯⋯29；i 万方数据2．3猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区PCR引物设计与合成⋯⋯⋯．．292．4猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．302．5猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位克隆测序与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．6猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位原核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯302．7BL21(DE3)一pET32一VPl原核表达菌的诱导表达与表达条件优化⋯．322．8重组蛋白的大量表达与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．332．9Western—blot检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．1猪嵴病毒VPl基因生物信息学分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．2密码子优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．3猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位PCR扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．4猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位TA克隆与鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯．373．5BL21fDE3)一pET32-VPl原核表达菌菌株构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．6BL21(DE3)-pET32一VPl原核表达菌的诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．7BL21(DE3)-pET32一VPI原核表达条件优化结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．8BL21(DE3)-pET32-VPI原核表达重组蛋白可溶性检测⋯⋯⋯⋯⋯．403．9BL21(DE3)一pET32-VPl原核表达重组蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．413．10重组表达蛋白Westem—blot检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．424讨论分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一43第三章猪嵴病毒抗体检测问接ELlSA方法的建立与初步应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯461材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯461．1实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．461_2实验器材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．461．3溶液及配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．461．4血清样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．462实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一472．1纯化重组蛋白浓度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．472．2间接ELISA方法的基本操作程序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯472．3抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一48 万方数据2．4抗原包被条件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．482．5封闭液的选择以及封闭时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．482．6血清样品最适作用时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．482．7酶标二抗工作浓度和作用时间的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．8底物作用时间的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．9临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．10特异性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯492．1l重复性实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯492．12临床样本的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯503实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．503．1纯化重组蛋白浓度测定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．503．2间接ELISA检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯503．3临床样本的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．544讨论分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．59致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．66攻读硕士学位之间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．67 万方数据第一部分文献综述1嵴病毒的发现及生物学分类嵴病毒属(Kobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)成员，嵴病毒属在第八次病毒学分类报告后被纳入微小核糖核酸病毒科，嵴病毒属成员为无囊膜的、单股正链RNA病毒【J1。嵴病毒属成员根据宿主可分为：人爱知病毒(Aichivirus)、牛嵴病毒(Bovi”Pkobuvirus)、猪嵴病毒(Porcinekobul，irus)等Ⅲ】。2013年，国际病毒分类委员会(ICTV)对嵴病毒属成员重新分类命名【5，61，规定现有嵴病毒属包括：AichivirusA、AichivirusB和AichivirusC；其中AichivirusA包括人爱知病毒(Aichivirus)、犬嵴病毒(Caninekobuvirus)和鼠嵴病毒(Murinekobuvirus)；AichivirusB包括牛嵴病毒(Bovinekobuvirus)和羊嵴病毒(Sheepkobuvirus)；AichivirusC目前只有猪嵴病毒(Porcinekobuvirus)。1989年，嵴病毒的原型株(Aichivirus)在日本Aichi县发现。通过电镜在非细菌性肠炎病人的粪便样品中观察到了一个直径约为30nm的球形病毒颗粒，此病毒能使BS—C一1细胞产生病变，RT-PCR和ELISA检测发现其与之前发现的腹泻病毒无关联，将这个新病毒命名为人爱知病毒(Aichivirus)【4】。电镜下Aichivirus病毒颗粒表面崎岖不平，在日语中“Kobu”代表隆起和鼓起的意思，为了和其他微小核糖核酸病毒科成员区别开来，将其归入嵴病毒属(Kobuvirus)。根据核苷酸序列和氨基酸序列，Aichiyirus又可分为A、B、C三个基因型【7一。2003年，牛嵴病毒U一1株在被胎牛血清污染了的Hela细胞培养液中检测到。通过电镜观察，U一1株形态和人爱知病毒相似，其基因组结构和其他微小核糖核酸病毒科成员类似，系统树图分析显示其属于嵴病毒属，且和人爱知病毒分属于不同分支，将其株归为嵴病毒属的第二位成员，命名为牛嵴病毒(Bovinekobuvirus)，现在属于Aichivir“SB[3]o2008年，匈牙利学者用RT-PCR检测无临床表现的仔猪粪便中的杯状病毒时，扩增得到一条非特异条带(约1100bp)，序列分析显示其与人爱知病毒和牛嵴病毒3CD区域有较高同源性，对全基因组序列(S一1．HUN株，GenBank登录号：EU787450)进行系统进化分析，表明这个新病毒属于嵴病毒属，即猪嵴病毒(Porcine]cobuvirus)，这是嵴病毒属的第三位正式成员[2|。 万方数据2嵴病毒形态学结构和基因组结构嵴病毒是球形的小病毒，无囊膜，直径大小约为30nm(见图1)，为单股正链RNA病毒，呈二十面体对称(见图2)。嵴病毒基因组全长为8．2—8．3kb，包含一个大的阅读框，编码一个多聚蛋白裂解为三个前体蛋白：P1(编码结构蛋白)、P2和P3(P2和P3编码非结构蛋白)【9。121。嵴病毒的基因组结构见图3，在5’有VPg蛋白与之共价结合，接着是5’UTR、前导蛋白L(Leader)位于多聚蛋白N端，随后依次编码是三个结构蛋白(VP0，VP3和VPl)以及七个非结构蛋白(2A．2C和3A一3D)的基因序列、3’UTR和多聚A尾巴【7，8，131。^孵KvirusU·1strain图1．电镜下的Aichivirus和牛嵴病毒U．I株(此图引用于TeruoYamashita,2003t3】)Fig1．ElectronmicrographofAichivirus，BovinekobuvirusstrainU·】negativelystainedwith2％phosphotungsticacid(pH7．2)for2min图2．嵴病毒病毒粒子模式图(来源于SIBExPASyBioinformaticsResourcePortal)Fig2．Kobuvirusvirionmodepattern 万方数据p1P2p3V￡'gg{玉叵匝应匡巨压五Ⅱ习j丑至p山蛆图3．嵴病毒基因结构图Fig3．Kobuvirusgenestructurediagram3嵴病毒基因组及其编码的蛋白质人爱知病毒A846／88株，猪嵴病毒S．I—HUN株，牛嵴病毒U．1株基因组全长分别为8280nt、8374nt和82lOnt(不包括多聚A尾)，分别编码2432aa、2463aa、2488aa大小的多聚蛋白【2’4，】J】。预测的剪切位点和其他微小核糖核酸病毒科成员类似，都在一个谷氨酰胺(Q)和另外一个其他氨基酸之间，通常是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或者是丝氨酸(S)，少数情况下是组氨酸(H)、半胱氨酸(C)或者苏氨酸(T)盼¨】。人爱知病毒A846／88株，猪嵴病毒S．1．HUN株，牛嵴病毒U一1株的5’UTR位于编码多聚蛋白的开放阅读框前面，长度分别为744nt、576nt和808nt，预测5’UTR包含一个和基因组复制有关的复杂二级／三级结构【】1，13,151。嵴病毒5’UTR前108nt核苷酸序列以及形成的茎环结构域(SL．A，SL．B，SL．C)的二级结构很相似，这可能是嵴病毒独有的特性，此外，高度的保守说明这个区域可能和病毒粒子的形成以及RNA的复制过程联系密切；人爱知病毒、牛嵴病毒、猪嵴病毒基因组序列5’UTR的3’末端部分相似性很低；三种嵴病毒的IRES基因序列差异明显，可能会形成三种不同类型的IRES结构，猪嵴病毒IRES序列与猪捷申病毒、鸭肝炎病毒1型IRES相似性高于其与人爱知病毒、牛嵴病毒之间的相似性；猪嵴病毒s一1．tIU-N株形成与丙型肝炎病毒结构类似的IRES，在其他微小核糖核酸病毒中也发现类似的结构，包括禽脑脊髓炎病毒、鸭肝炎病毒1型、猪捷申病毒和猪肠道病毒8型等‘7，8，11,13,15。91。学者推测，猪嵴病毒类似丙型肝炎病毒的iRES可能是通过与其他病毒发生基因重组的结果。人爱知病毒和牛嵴病毒的IRES结构与功能尚不明确。嵴病毒和其他微小核糖核酸病毒科成员编码区的主要区别在于L蛋白、VP0蛋白缺少一个剪切位点，以及2A蛋白独特的构成；L蛋白大小为170．195aa，没有自催化活性，不参与多聚蛋白的剪切，与RNA的复制和病毒的衣壳化有关，A846／88、U．1、S．1．HUN的P1多聚蛋白大小分别为846aa、857aa和843aa，VPI蛋白大小分别为254aa、267aa和253aa[7，11，15,2们。VPl蛋白是嵴病毒暴露最多的衣壳蛋白，也是嵴病毒中变异最大的结构蛋白，是中和抗体的主要结合位点‘3，7=14,17,2¨。A846188、3 万方数据U．1、S．1一HUN的P2和P3蛋白长度不一，S．1．HUN的P2蛋白氨基酸序列(非结构蛋白2A．2C)与U．I和A846／88的相似性分别为68％帮159％111，13，151。2A蛋白氨基酸序列的相似性在53％．69％之间，包含一个保守的H．box／NC蛋白和一个跨膜区，H．box／NC基序与控制细胞增殖和病毒RNA复制有关【7，11，13,151。S一1．HUN的2B区域包含一个30aa长度的串联重复序列，嵴病毒2B蛋白功能尚不清楚，但是在不同微小核糖核酸病毒中，2B蛋白的功能各不相刚13，151。三个嵴病毒之间2c蛋白相对保守，氨基酸序列相似性为68．77％，包含一段高度保守的氨基酸序列(GXXGXGKT)，这个基序是微小核糖核酸病毒解旋酶的核苷酸结合位点【7，11，13,J5】。S．1．IIUN的P3蛋白(非结构蛋白3A一3D)与U-l、A846／88氨基酸相似性分别为71％和63％，其中和3B蛋白氨基酸相似性最低(26％)，和3D最高(81％)1111。3C蛋白是一个半胱氨酸蛋白酶，包含一个保守的微小核糖核酸病毒催化三联体，由组氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸组成，多聚蛋白的裂解都是由这个蛋白酶完成的【7，11，13,151。嵴病毒3D蛋白是一个RNA依赖性RNA聚合酶，包含KDELR、YGDD和FLKR三个高度保守的氨基酸基序。嵴病毒3’UTR长度为167．237nt，基因序列相似性较低，其二级结构尚不清楚，但可能在RNA负链的合成中超重要作用；嵴病毒基因组碱基组成和其他微小核糖核酸病毒相比，嘧啶碱基(c和u)含量较耐7，11,13,15-17,191。4嵴病毒生物学特性嵴病毒和其他微小核糖核酸病毒类似，在酸性环境中(pH3．5)相对稳定，耐氯仿、乙醚和非离子去污剂，但是不耐热，60。C条件下30min就会崩解【】】，15—71。嵴病毒原型株A846／88能使非洲绿猴肾上皮细胞系产生病变，如BS．C．I细胞和Vero细胞，但不能在人源细胞上增殖，如Hela细胞、HEL和RD细胞，也不能在新生鼠源细胞上培养；牛嵴病毒和猪嵴病毒尚未能实现体外分离培养‘3，4，L1I,15-|7,2刁。嵴病毒宿主范围广，除了在人、牛、猪中检出，在多种其他动物中也检出了嵴病毒，如：绵羊、野猪、LLI羊、狗、猫、蝙蝠和鼠等‘2’4，10,23枷】。5嵴病毒流行病学5．1人爱知病毒人爱知病毒在世界范围内广泛分布，目前认为人爱知病毒是通过粪．口途径传播 万方数据的，所以其预防主要是依赖干净饮用水的供给，讲究个人卫生，不吃生的、没有煮熟的食物。研究表明，人爱知病毒和一系列临床疾病有关，包括腹泻、呕吐、发烧、化脓性结膜炎和呼吸道疾病。在日本的血清学调查结果显示，人爱知病毒抗体阳性人群随着年龄的增长而增多，青年组爱知病毒抗体阳性率约为30％，中年人群中阳性率攀升至80％1221。西班牙、德国、突尼斯人群血清样本中爱知病毒抗体阳性率为70％、76％矛1192％【31-33]。爱知病毒抗体在人血清中检出率高，但爱知病毒抗原在急性胃肠炎病人中的就检出率却很低。在从东南亚国家返回日本的人群中，爱知病毒的检出率为0．7％13们。中国的研究报道表明，从上海某医院中获取的儿童粪便样本中，爱知病毒的阳性率为1．8％【351。巴基斯坦爱知病毒检出率为2．2％(5／222)，此外，从日本、泰国、越南和孟加拉国收集的912份来自儿科门诊的急性胃肠炎粪便样本中，28份(3．07％)呈爱知病毒阳性№371。在芬兰、法国、匈牙利、德国和瑞典等欧洲国家，爱知病毒的检出率为0．5％一1．6％【3l，381。在西班牙、突尼斯急性胃肠炎病人中也检出爱知病毒阢3引。5．2牛嵴病毒血清学实验表明，牛血清和牛嵴病毒u．1株存在中和反应【31。日本、泰国、韩国、比利时、匈牙利、荷兰、意大利和巴西都报道了牛嵴病毒的检出，阳性率在1％．34．5％之间，其中在韩国腹泻牛中的检出率最高‘13，40421。5．3猪嵴病毒猪嵴病毒在世界各国猪群中广泛流行，无腹泻的猪和腹泻猪均能感染。在目前报道发现了猪嵴病毒的国家里，猪嵴病毒在粪便样本中的阳性率从16．7％到99％：在匈牙利的同一个农场里，2007年和2008年无临床表现的猪群中猪嵴病毒的检出率分别为65％(39／60)和53．3％(32／60)；在西班牙北部，2011年猪嵴病毒阳性率为48．7％；在泰国，2001．2003年收集的猪腹泻样本中猪嵴病毒的检出率为99％(97／98)，2006．2008年收集的腹泻样本中猪嵴病毒的阳性率为97％(127／131)；在日本的无腹泻猪群中，2010年报道猪嵴病毒的阳性率为45．4％(133／2931；2010年在韩国，来自三个省的无腹泻猪粪便样本和腹泻样本中猪嵴病毒的检出率分别为45．5％(15／33)和32．6％(28／86)，来自韩国八个省的样本中，无腹泻猪和腹泻猪中猪嵴病毒的阳性率分别为19．3％(16t83)和84．5％(71／84)；2011年，据报道，巴西和荷兰猪嵴病毒的检出率分别为53％(61／115)；fn16．7％(3／18)；2013年，美国报道猪嵴病毒在无腹泻猪群中S 万方数据的感染率为21．7％(10／46)，在腹泻猪群中的检出率为21．9％(25／114)；2013年在捷克斯洛伐克无腹泻猪群中，猪嵴病毒的总阳性率为87．2％(171／196)：2013年巴西学者报道，在2004．2011年收集的哺乳仔猪(1．3周龄)粪便中，猪嵴病毒的阳性率为76．2％(48／63)；2013年东非报道，猪嵴病毒的检出率为13．1％(33／251)；意大利无腹泻猪群中，猪嵴病毒感染率为3．85％(10／260)【2，43锄]。猪嵴病毒在中国无腹泻和腹泻猪粪便样本中也有较高检出率。目前，28个省、直辖市或自治区报道在肠道样本中检出猪嵴病毒。在不同地区，猪嵴病毒在粪便中的阳性率从11．2％一100％[16，19,56,58枷1。见表1(注：部分猪嵴病毒阳性率数据是将几篇报道中数据汇总计算出的)。表1．猪嵴病毒在中国各地流行情况Table1．PrevalencerateofporcinekobnvirusinpigsfromdifferentregionsofChina在国内，除了表l中列出的地区，天津市、重庆市、山西省、辽宁省、吉林省、黑龙江省、江苏省、福建省、山东省、贵州省、云南省、陕西省、青海省和宁夏回族自治区猪群中均检出了猪嵴病毒(感染率不详)。猪嵴病毒在全国范围内广泛流行。国外学者Reuter和Barry等都报道在猪血清中检测到了猪嵴病毒抗原14t5ll。中国学者也在猪血清中检测到了猪嵴病毒抗原：来自甘肃的血清样品猪嵴病毒阳性率为33．3％(2／6)，湖南、湖北和河南的样品总检出率为6．5％(6／92)1691。 万方数据此外，中国兽医药品监察所研究人员，在母猪初乳样品中检出了猪嵴病毒：北京66．7％(2t3)，新疆80％(4／5)，内蒙古84．2％(16／19)[691。6嵴病毒的实验室诊断嵴病毒的实验室诊断方法主要包括：病毒的分离培养、电镜技术、免疫学方法和RT-PCR、实时荧光定量PCR。用病毒分离培养法检测人爱知病毒，敏感性会降低，其可行性尚待商榷，且牛嵴病毒和猪嵴病毒分离培养尚未寻找到敏感细胞系【22】。在电镜下观察，球形的嵴病毒有独特的亚显微结构，但是不容易和其他小的球形病毒区分开来，会被误划分为星状病毒。日本学者研制爱知病毒的单克隆抗体，以检测嵴病毒抗原，此法灵敏度高于病毒分离培养19】。在嵴病毒检测和基因分型时，分子生物学方法(包括RT-PCR、荧光定量PCR)使用最广泛。Reuter等根据嵴病毒3D基因保守序列，设计了一对通用引物，这为嵴病毒快速检测提供了方便【¨J。总的说来，在实验室用分子生物学方法(RT-PCR、实时荧光定量PCR)检测嵴病毒是最敏感快捷的方法。本研究的目的与意义猪嵴病毒属于微小核糖核酸病毒科，嵴病毒属。2008年，匈牙利学者在无临床表现的猪群中首次发现了猪嵴病毒；2009年，中国猪群中也报道检出猪嵴病毒。自此之后，多个国家在猪群中检出了猪嵴病毒，包括泰国、日本、韩国、荷兰、巴西、西班牙、意大利、东非等。猪嵴病毒是一种具有传染性、在世界范围内广泛分布的新型病毒，在没有腹泻的猪和腹泻猪粪便样本中都有较高检出率。猪嵴病毒尚不能被分离纯化，限制了很多更进一步的研究。猪嵴病毒感染和动物疾病的关系尚不明确，对猪嵴病毒病的流行病学特征、可能引起的临床症状尚需更多研究来定论。猪嵴病毒的致病性与致病机制尚不明确，无法实现临床诊断，现在基因检测依然是猪嵴病毒检测的主要方法，也是分子流行病学研究的有效技术手段。随着对猪嵴病毒基因组、蛋白功能、免疫学特点等研究的深入，需要建立起更多快速、准确，且能适应各种需要的检测方法。本研究应用RT-PCR方法检测猪嵴病毒在四川I地区无腹泻的猪群和腹泻猪群中的感染情况，了解四川地区猪嵴病毒的流行和感染情况；利用克隆、测序获得猪嵴病毒主要结构蛋白VPI基因序列，通过与GenBank中登录的其他地区猪嵴病毒VPI基因 万方数据进行序列分析，了解四川株猪嵴病毒VPI基因分子流行病学特点。VPI蛋白为嵴病毒暴露在最外面的衣壳蛋白，是嵴病毒主要的优势免疫蛋白。本研究通过大肠杆菌原核表达系统，表达猪嵴病毒VPI优势抗原表位区域，将重组蛋白纯化后用于建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的问接ELISA方法，以了解猪嵴病毒在猪群中感染情况。建立的间接ELISA检测方法，适用于猪嵴病毒抗体的大批量检测，可以作为猪嵴病毒ELISA检测试剂盒的技术储备，为以后猪嵴病毒血清学检测方法研究奠定基础。 万方数据第二部分实验部分第一章2011-2012年四川地区猪群猪嵴病毒感染情况调查及猪嵴病毒VPI基因分子流行病学调查分析1材料与试剂1．1实验试剂2xTaqPCRMasterMix、DNAMarkerDL2000购自天根生物；TaKaRaRNAisoPlus、PrimeScriptRTKit、pMDl9一TSimpleVector、SolutionI、PrimeSTARPremix、TaqDNA酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；凝胶回收试剂盒购自博迈德公司：酵母提取物、蛋白胨为Oxoid产品；其余试剂均为国产分析纯。1．2实验仪器漩涡混合振荡器(北京中西远大科技有限公司)；PYX．DHS隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂)；超净工作台(AIRTECH)；PCR仪(BIO．PAD公司)；DYY-III稳压稳流电泳仪、DYYolII水平电泳槽(北京六一仪器厂)；全自动凝胶图象分析系统(BIO．RAD公司)；SHZ．82A恒温振荡器(常州国华电器有限公司)：电子天平(德国赛多利斯)；超速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司)；微量移液器(德国Eppendorf)。1．3溶液及配制PBS溶液：NaCl89，KCl0．29，Na2HP041．159，KH2P040．29，加双蒸水溶解后，将pH调为7．4左右，加双蒸水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)备用。氨苄青霉素溶液：将氨苄青霉素粉用灭菌双蒸水溶解，配置成100mg／mL，用滤器过滤，分装，一20℃备用。LB液体培养基：称取Tryptone109，YeastExtract59，NaCI109，用800mL双蒸水溶解后，加入NaOH将pH调为7．2—7．4左右，加入双蒸水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌(12l℃，15rain)后于常温下储存。9 万方数据氨苄琼脂平板：在液体LB中加入琼脂粉，约1．2一1．5％，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后，待冷却至55。C左右，加入Amp至终浓度为o．Ig／L，倾注灭菌培养皿。5xTBE电泳缓冲液：Tris549，硼酸27．59，0．5MEDTA(pH8．0)20mL，定容至1L。1％琼脂糖凝胶：80mL去离子水，20mL5xTBE电泳缓冲液，19琼脂糖，使用时加入溴化乙锭(EB)至终浓度为0．5mg／mL。0．1MCaCl2溶液：CaCl25．559，用双蒸水溶解后定容至500mL，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)各用。1．4临床样品2011-2012年期间实验室采集保存的163份猪粪便及肠道样品，样品覆盖了四川省18个地区。其中来自腹泻猪的样品为112份，51份样品来自无腹泻症状的猪群；按年龄划分，93份来自哺乳仔猪，23份来自断奶猪、】7份来自育肥猪、30份来自成年母猪。1．5菌株E．ColiDH5c￡菌种由本实验保存。2实验方法2．1引物合成2．1．1猪嵴病毒检测引物根据中国疾病预防控制中心建立的猪嵴病毒RT-PCR检测方法合成引物，该引物是基于猪嵴病毒3D基因保守序列设计，目的片段大小是495bpll21，引物序列如下：3D．F：5’一TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC-3’3D．R：5’一AGTGCAAGTCTGGGTTGCAGCCAACA一3’2．1．2猪嵴病毒VPl基因扩增引物本研究中，猪嵴病毒VPl基因的扩增分两步完成。根据GenBank中公布的猪嵴病毒全基因序列(登录号：EU787450、GQ249161、JN630514、JQ692069)设计两对引物扩增猪嵴病毒VPl基因，外套引物(PolyproteinF／R)扩增猪嵴病毒多聚蛋白基因(扩增范围包括VPl基因全序列，以及部分VP3和部分2A基因序列)，预扩增片1订 万方数据段为1229bp左右；第二对引物(VPIF／R)扩增猪嵴病毒VPl基因序列，预扩增片段为706bp。将引物送宝生物工程(大连)有限公司合成。表1-1猪嵴病毒vPl基因扩增所用引物序列Table1-1PrimersforporcinekobuvirusVPlgeneamplification2．2样品的处理及总RNA提取取约19猪粪便或肠内容物aria10mLPBS溶液中，在漩涡混合振荡器上混匀，制成10％的混悬液，将混悬液在4℃40009离心10min，所得上清液将用作提取总RNA。以TakaraRNAisoReagent试剂说明书方法提取上清液总RNA。具体步骤如下：(1)取300“L处理后的粪便上清液与500灶LRNAiso颠倒混匀；(2)室温静置5rain，4。C1200095min；(3)加入IOOpL氯仿，剧烈振荡成乳浊液，在冰盒中静置5min，4。C12000915min：(4)取上层水相，加入等体积异丙醇，一20。0沉淀20min，4"C12000910rain，弃上清；(5)加入lmL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，4。C1200095min，弃上清；(6)待乙醇挥发完全后，加入30止无RNAase水溶解总RNA。2．3反转录制备cDNA以上步抽取的总RNA为模板，用TaKaRa公刮反转录试剂盒(PrimeScriptTMRTreagentkit)将提取的RNA进行反转录，反转录反应体系(10rm)具体如下：5xPrimeScriptTMRTBuffer2．09LPrimeScriptTMRTEnzymeMix0．59LOligodTprimerO．5uLRandomprimer0．5pLTotalRNA3．O吐ddH，O3．5UL反转录程序：37℃20min，85℃5s，16℃OO；反转录制备的cDNA保存于一20℃备用。 万方数据2．4猪嵴病毒PCR检测用2．1中的猪嵴病毒检测引物对3D。F／R，以23中反转录的cDNA为模板进行PCR检测。猪嵴病毒PCR检测反应体系如下(20pL)：2×TaqPCRMasterMix1O．0pLddH208．0LLL3D—F(20pm01)0．5uL3D—R(20pm01)0．5LLLcDNA模板1．0gLPCR程序：95。C预变性4min；95℃变性30s，55"C退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72。C终延伸7rain。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Bio．Rad全自动凝胶成像仪观察结果。2．5生物统计学分析根据不同因素(年龄、腹泻／无腹泻)将163份样品检测结果进行统计，利用SPSS21．0软件，对检测样品中猪嵴病毒感染情况数据进行差异分析，用Pearson卡方适合性检验分析同一因素各个分组问是否存在显著差异。P<0．05为显著(significant)；P<0．001为极显著(extremesignificant)。2．6猪嵴病毒VPl基因扩增以猪嵴病毒阳性样品cDNA为模板，用引物对PolyproteinF爪和VPlF／R扩增猪嵴病毒VPI基因序列。PCR反应使用TaKaRa公司的Premix(含有PrimeSTARHSDNA聚合酶，此酶具有高保真性和高扩增效率)进行，反应体系如下(50pL)：PrimeSTARHS(Premix)25．0gLddH2018．0pL引物F(20pm01)2．0gL引物R(20pm01)2．0gL模板3．0gL第一轮PCR以猪嵴病毒阳性样品cDNA为模板，第二轮PCR模板为第一轮PCR产物。第一轮PCR程序：98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸20s，重复30个循环；1’ 万方数据72。C终延伸5min。第二轮PCR将每个循环的延伸时间缩减为10s，其余反应条件不变。待PCR反应完成后，在反应混合物中(501aL体系)加入O．59LTaqDNA聚合酶(5U／HL)，并在72。C孵育30min，此步骤可在PCR产物的3’端加入“A”碱基，便于后续分子克隆实验。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Bio．Rad全自动凝胶成像系统观察结果。2．7目的DNA片段的回收PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察，用干净刀片切取含目的条带的琼脂糖凝胶(尽量切除多余部分)，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明进行目的片段回收。具体操作步骤如下：(1)将切下的含有DNA条带的琼脂糖凝胶称重；(2)加入3倍体积的溶胶液(凝胶重为100mg，其体积可视为1009L，则加入3009L溶胶液)；(3)将加入了溶胶液后的离心管放在55℃．60℃水浴中10rain，直至凝胶完全融化(其问每2-3min将离心管颠倒混匀，以加速凝胶溶解)；(4)溶胶液冷却至室温后，加入吸附柱室温静置2min，120009离心30，60s，倒掉收集管中的废液；(5)加入700pL漂洗液，120009离心30s，弃液；重复一次；(6)将吸附柱放回空收集管中，120009离心2min，尽量除去漂洗液；(7)取出吸附柱，放置于EP管上，超净工作台室温干燥10min，加入30—50皿预热至65。C左右的EB洗脱缓冲液，室温静置5min，120009离心Irain洗脱DNA。2．8分子克隆2．8．1大肠杆菌DH5Q感受态细胞制备大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备，具体操作步骤如下：(1)挑取DH5a单菌落接种到15mL液体LB，37。C振荡培养过夜；(2)取lmL过夜培养的菌液，接种到20mL新鲜液体LB中，37。C200r／rain培养2h；(3)将上步所得菌液转入两个尖头离心管中，冰浴30min，4000946C离心10rain，弃上清；(4)每管加入10mL预冷的0．1MCaCl2重悬菌体沉淀，用吸管吹打混匀，冰浴10rain，400094。C离心】0rain，弃上清；重复～次；(5)向每个离心管中加入lmL预冷的0．1MCaCl2，用吸管吹打重悬菌体，并分装成2001aL／每管，静置于冰浴中6～12h后可使用。1弓 万方数据2．8．2连接与转化将2．7中回收的DNA片段连接至pMDl9．Tsimplevector，连接体系如下(101aL)：SolutionI5．0faLpMDI9-TsimpleVector0．5此回收的DNA片段4．5皿充分混匀后在16℃连接4～6h。连接产物转化DH5a感受态细胞，具体步骤如下：(1)将连接产物与200／aLDH5a感受态细胞混匀，冰浴30min；(2)42。C水浴热激90s，再冰浴2rain；(3)加入800BL液体LB，37。C振荡培养lh；(4)取1201aL上步所得菌液，用玻璃棒均匀涂布在预先制备好的氨苄青霉素LB琼脂平板上，将平板置于恒温培养箱中，37。C培养12～16h。2．8．3重组质粒的筛选鉴定与测序挑取氨苄平板上长出的单个菌落，接种到10mL含氨苄青霉素(0．19／L)的液体LB培养基中，37。C200r／min摇床震荡培养12h。取5mL菌液，使用OMEGA公司质粒小量抽提试剂盒E．Z．N．A．TMPlasmidMiniKit，参照说明书提取重组质粒DNA，具体操作步骤如下：(1)平衡结合柱步骤：取一个新的HibindDNA结合柱装在收集管中，取200uL的BufferGPS平衡缓冲液上柱；室温放置3．5rain：120009离心2min；倒弃收集管中滤液，将HibindDNA柱子重新装在收集管中；(2)将5mL茵液，40009离心5min，弃上清；(3)往菌体沉淀中加入2509L溶液I(P1)／RNaseA混和液，涡旋振荡使菌体细胞完全重新悬浮，转移至干净的1．5mL离心管中；(4)加入250此溶液II(P2)，轻轻颠倒混匀，菌液逐步由浑浊变清亮；(5)加入350I_tL溶液111(P3)，温和颠倒混匀，待出现白色絮状沉淀，120009离心10min；(6)将上步所得上清加入平衡好的结合柱中，室温静置3-5rain，120009离心30—60s，弃废液；(7)把结合柱重新装回收集管中，加入500HLBufferHB，120009离心30．60s，弃废液；(8)加入7001aL漂洗液DNAWashBuffer，120009离心30—60s，弃废液；重复一次；(9)120009离心2min，尽量除去漂洗液；(10)将结合柱在超净工作台中室温干燥5rain，加入30—501aL洗脱缓冲液EB，静置5rain，120009离心2rain洗脱质粒DNA；将质粒DNA保存在一20。C备用。以重组质粒DNA为模板，用引物VPlF／R对重组质粒进行鉴定，反应体系(159L)：ld 万方数据2。11aqPCRMasterMix7-5btLddH206．0LLLVPl一F(20pm01)0．5gLVP2-R(20pm01)0．5gL质粒DNA0．5此PCR反应程序：95。C预变性4min；95℃变性10s，50。C退火20s，726C延伸20s，重复30个循环；72。C终延伸5rain。PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。2．9猪嵴病毒多聚蛋白基因的基因多样性分析随机选取部分猪嵴病毒阳性样本cDNA，按照2．6中方法扩增猪嵴病毒VPl基因，用2．7和2．8描述的方法，将目的片段回收后进行分子克隆，并选取阳性质粒送公司进行测序。少量样品通过2．6第一轮PCR，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳后可见明显的单一目的片段(1229bp左右)，将对应的琼脂糖凝胶切下，使用Biomed公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的DNA片段的回收，具体操作步骡参照2．7，将回收得到的DNA片段，连同引物PolyproteinF／R送生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析。有两份样品(分别命名为样品A、B)，分别以其cDNA为模板，用引物PolyproteinF／R按照2．6的反应体系和反应程序，用含高保真酶的Premix重新扩增猪嵴病毒多聚蛋白基因，反应完成后，在反应混合物中(509L体系)加入O．59LTaqDNA聚合酶(5U／gL)，并在72"C孵育30min，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳后按照2．7方法回收DNA片段，参照2．8进行分子克隆，每个样品选取十个阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。2．1O序列相似性分析和系统进化树分析使用DNASTARLasergene7．1软件中MegAlign，分别对2．9中测得的猪嵴病毒VPl基因序列和猪嵴病毒多聚蛋白基因序列进行相似性分析。从GenBank中下载来自其他地区的猪嵴病毒VPl基因序列，以及其他嵴病毒成员代表株VPl基因序列，用MEGA5．0软件中Neighbor—JoiningMethod(NJ法)构1S 万方数据建系统进化树，其余参数设置：BootstrapReplications：1000；Model：Kimura2-parametermodel。2．11重组分析重组分析主要是利用重组分析软件(RecombinationDetectionProgram，RDP)矛USimplot3．5．1完成的【72,73]。利用RDP4．16中AutomatedBootscan模块进行初步筛查，找出亲本株和重组序列：然后利用Simplot3．5．1进行相似性分析和Bootscan分析(运行SimPlot软件至少需要四条序列，一条重组子序列，两条亲本序列，以及一条同种序列作为外群序列)。3实验结果3．1猪嵴病毒3D基因的RT-PCR扩增以从临床样品中提取的总RNA反转录合成的cDNA作为模板，用引物对3D．F／R对样品进行猪嵴病毒检测，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，阳性样品在全自动凝胶成像仪下可见到一条与预期大小相符的条带，约为495bp(图l一1)。M：DL2000DNA相对分子质量标准；1：阳性样品；2：阴性对照图1．1．猪嵴病毒RT-PCR检测结果M：DNAMarkerDL2000；1：Postivesample；2：NegativecontrolFig1-1．RT-PCRdetectionofPKoV3．2猪嵴病毒抗原RT-PCR检测结果本研究总共检测了163份2011．2012年从四川猪场中收集的样品，猪嵴病毒总阳性率为53．4％(87／163)，腹泻样品中的猪嵴病毒总阳性率为64．3％(72／112)，采集自无腹泻症状猪的样品中，猪嵴病毒的感染率为29．4％(15／51)。哺乳仔猪、保育猪、育16Q叭∞如∞如∞__DrⅡO752l 万方数据肥猪和母猪中，猪嵴病毒的感染率依次为：66．7％、39．1％、23．5％、40．O％。17个地区的检测出猪嵴病毒。统计结果见表1．2、1．3。表1．2．猪嵴病毒RT-PCR检测统计结果(按年龄和症状统计)Table1-2．RT-PCRdetectionresultsofPKoV(Groupedbyageandsymptom)8猪嵴病毒抗原阳性个数／检测的样品总数表1—3．四川地区猪嵴病毒流行情况统计Table1-3．PrevalencerateofPKoVindifferentregionsofSichuanProvince3．3生物统计分析结果检测的163份样品中，112份来自腹泻猪，51份来自无腹泻症状的猪。腹泻样品中，猪嵴病毒阳性率为64．3％(72／112)，无腹泻症状的猪中猪嵴病毒阳性率为29．4％(15／51)，利用SPSS21．0软件对腹泻组和无腹泻组猪嵴病毒感染数据进行卡方检验，腹泻组数据具有极显著性差异：爿2=17．126，P=3．5x10—50．05。3．4猪嵴病毒VPI基因扩增结果随机选取猪嵴病毒阳性样品，以其cDNA为模板，用两对引物(引物PolyproteinF／R和VPlFIR)扩增猪嵴病毒VPl基因序列，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，可见单一目的条带，约706bp，见图1．2。bE20001000750500250100M：DL2000DNA相对分子质量标准；1：阳性样品；2：阴性对照图1．2．猪嵴病毒VPI基因扩增结果M：DNAMarkerDL2000；1：Postivesample；2：NegativecontrolFig1-2．AmplificationofPKoVVPIgene将目的片段所在琼脂糖凝胶切下，回收DNA片段，将胶回收产物克隆到pMDl9一TSimpleVector，每个样品选取一个阳性克隆送公司测序，总共测得30个666bp(除去载体序列和引物序列)猪嵴病毒VPl基因序列，将序列上传至GenBank，序列登陆号为KFl57917．KFl57946，它们之间的核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性分别为82％一100％和86．9％一100％。3．5猪嵴病毒多聚蛋白基因的基因多样性分析结果3．5．1猪嵴病毒多聚蛋白基因胶回收产物测序少量样品通过方法2．6中第一轮PCR，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳后可见明显的单一目的片段，约1229bp左右(多数样品第一轮PCR产物电泳后无条带出现)，见图1．3。 万方数据照p20001000750500250100M：DL2000DNA相对分子质量标准；1：阳性样品；2：阴性对照图1-3．猪嵴病毒多聚基因扩增结果M：DNAMarkerDL2000；1：Postivesample；2：NegativecontrolFig．1-3AmplificationofPKoVpolyproteingene切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，并将胶回收产物连同引物PolyproteinF／R送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。用chromas软件打开abl格式的图谱文件，查看测序结果的峰形图。在正常情况下，峰形图中一个峰对应一个碱基。分别打开样品A、B胶回收产物测序图谱，观察其峰形图时，可看到在个别碱基位置，有杂峰信号的出现，见图1-4。jS”{f+{j—rq‘啦档午^r。^tp?：扎如崔r：p}肾A{*^图1-4．测序色谱图(红色箭头标记处为杂峰信号)Fig1—4．Sequencingchromatogram(Noisepeakwasmarkedwithredarrow)3．5．2猪嵴病毒多聚蛋白的分子克隆与测序分析使用引物PolyproteinF／R，用含高保真酶的Premix扩增样品A、B的猪嵴病毒多聚蛋白基因，在PCR产物3’加上‘‘A”碱基后，将胶回收产物进行分子克隆。将10个阳性质粒测序得到序列(不含引物序列)分别命名为A1．A10和B1．B10。通过NCBI中BLAST比对，确认这20个序列都属于猪嵴病毒。通过DNASTAR软件中MegAlign对分别对样品A中获得的10个长度为1190bp(不含引物序列)的核苷酸序列进行相似性分析：序列A1和A4相似性为100％；序列A3和A5、A6⋯⋯A10的相似性为100％，即从样品A中获得3个序列：A1，A2，19 万方数据A3。在样品B中，序列B1和B3一B6、B8、B9、B10，这8个序列的相似性为100％，序列B2和B7的相似性为100％，即从样品B中获得2个序列：BI、B2。将获得的5个猪嵴病毒多聚蛋白基因序列上传至NCBI，获得GenBank登录号：A1(KFl57947)、A2(KFl57948)、A3(KFl57949)、BI(KFI57950)、B2(KFl57951)。序列A1．A3、BI—B2核苷酸序列相似性及其推导的氨基酸序列的相似性，见表】．4。表1-4．猪嵴病毒多聚蛋白核苷酸序列和氨基酸序列相似性Table1-4．NucleotideandaminoacidsimilarityamongthePKoVpolyproteinsequences注：右上角为核苷酸相似性；左下角为氨基酸相似性3．6系统进化树分析结果将获得的35个四川株猪嵴病毒VPl基因序列，连同从GenBank中下载的其他地区猪嵴病毒VPI基因序列，以及其他嵴病毒成员代表株VPl序列，用MEGA5．0软件构建系统进化树，见图1．5。从进化树中可见，获得的35个序列和猪嵴病毒成员亲缘关系更近，形成独立大分支，与其他嵴病毒属成员区别开来，本研究测得的35个猪嵴病毒VPl基因序列，分属于四个大群(ClusterA、B、C、D)。全部猪嵴病毒VPl基因序列的分群无明显地域性差异。3．7重组分析结果用RDP4．16进行初步检测发现，KFl57947一A1、KFl57948一A2、KFl57949．A3三个序列之间存在重组现象，其中KFl57948．A2为重组子序列，KFl57947一A1和KFl57949．A3为亲本序列。运行SimPlot3．5．1，以KFl57948．A2为重组子序列(Query)；KFl57947．AI和KFl57949-A3为亲本序列(Referencesequences)：KFl57951一B2作为外群序fflj(Other)。SimPlot预测结果进一步确认了A1、A2、A3这三个序列之间存在基因重组。相似性分析(Similarity)展示亲本序列与重组序列之间核苷酸相似性，见图1—6，如图可见，在588nt之前，重组子序列A2和亲本序列A1之间相似性更高，但是在809nt之后，重组子序列A2与亲本A3序列之间的相似性更高。在588—809nt区间，两个亲本之间发生了交叉，即两个亲本序列和重组子序列之问的相似性相同，这个区域就是发生基因重组的区域。2fl 万方数据F-----I图1—5．四川株猪嵴病毒VPI基因序列系统进化分析(●代表本研究中获得的猪嵴病毒序列▲代表其他研究中测得的四川株猪嵴病毒VPI序列)Fig1-5．PhylogeneticanalysisofPKoVVPlproteinsequencesdetectedinSichuanprovincerFilledquadrate■indicatesPKoVVPIproteinsequencesobtainedinthisstudy．Filledtriangle▲representsaSichuanstrainPKoVVPIproteinsequencehasbeenreportedinOUrpreviousstudy 万方数据rOSltlonInllWindow：200bp，Step：20bp．GapStrlp：On。Kimura{2一parameter)．T／t：2．0图1-6．亲本序列和重组序列核苷酸相似性分析Nucleotidesimilaritycomparisonbetweentheputativeparentalstrainsandthepossiblerecombinationstrain重组子序列及其亲本序列的BootScan分析结果见图l一7，纵坐标上的数值代表在进化树中重组序列与亲本序列聚成一簇的支持率，当在BootScan分析图中见到Query序列不同区段与不同Referencesequences亲缘关系近时，即说明在Query序列和Referencesequences之间发生了重组。在第一个断点(Breakpoint)609nt之前，重组序列A2和亲本序列A1亲缘关系更近；从609．635nt和676—759nt，重组序列A2和亲本序列A3亲缘关系更近；从635—676nt和759．835nt重组序列A2和亲本序列A1亲缘关系更近；最后一个断点835nt后，重组序列A2和亲本序列A3亲缘关系更近。800tScan-Query：A2Position(nt)Window：200bpStep：20bp，GapStrip：On,Reps：100．Kfmur8t2-parejmeter)．Tm2．0NeigiTbor,,Jou．rig图1．7．重组序列Bootscan分析Fig1-7．Bootscananalysisoftheputativerecombinantsequence4讨论分析本研究中，2011-2012年在四川地区猪场中收集到163份猪粪便样本，猪嵴病毒22 万方数据总检出率为53．4％(87／163)，其中腹泻猪感染率为64．3％(721312)，无腹泻猪感染率为29．4％(15／51)。猪嵴病毒在四川猪群中广泛流行，无腹泻猪和腹泻猪均有较高感染率。在国外学者的研究报道中，猪嵴病毒在猪粪便中的检出率为3．85％一99％f2，26,43，44,46-55,57。59，62，641。在无临床表现的猪群中，匈牙利、日本、韩国、巴西、美国、捷克斯洛伐克、东非地区和意大利的感染率分别为65％(39／60)和53．3％(32／60)、45，4％(133／293)、19_3％(16t83)：乖1145．5％(15t33)、41％(32178)和80％(4／5)、21．7％(10／46)、87．2％(17I／196)、13．I％(33／251)、3．85％(10／260)；在腹泻猪群中，猪嵴病毒检测率在泰国、韩国、巴西、美国分别为99％f97／98)和97％(127／131)、32．6％(28／86)干N84．5％(71／84)、21．9％(25／114)、78．4％(29137)和75．9％(44／58)。综合国内学者对猪嵴病毒流行病学的研究，目前已在28个省、直辖市或自治区的猪群中检出了猪嵴病毒，其中在粪便样本中的检出率为从11．8％到100％f16，17．19,47,56,59-62,65,67舶j。猪嵴病毒在世界范围内广泛流行，检出率的差异可能是因为与样本相关的因素造成的，例如：采样的时间、采样的地域范围、是否是腹泻样本以及采样猪群的年龄等。本研究中通过生物统计学软件分析猪嵴病毒在腹泻猪群和无腹泻猪群中的感染率，分析结果显示猪嵴病毒感染和腹泻具有极显著相关性，类似的结论也出现在上海、巴西和韩国的猪嵴病毒流行病学调查中。其中，在韩国的文献中，Park等对猪腹泻样本中的病原进行筛查，检测项目包括猪流行性腹泻(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒A型(GARV)、猪诺如病毒(PNoV)、猪札幌病毒(PSaV)、猪环曲病毒(PToV)以及产气荚膜梭状芽胞杆菌、胞内劳森氏菌、猪痢疾短螺旋体、沙门氏菌、产毒素大肠杆菌等常见猪腹泻病原，猪嵴病毒阳性率为84．5％(71／84)，其中68份猪嵴病毒阳性样本与其他猪腹泻病原混合感染，有3份病料只检测到猪嵴病毒【53|。这些数据暗示，猪嵴病毒感染可能和猪腹泻的发生存在一定联系，但是鉴于猪嵴病毒在无腹泻猪群中也普遍存在，其致病性以及在猪肠道疾病中的角色尚无定论。根据现有的流行病学数据，推测可能存在如下情况：(1)存在两种基因型的猪嵴病毒，一种是具有致病性，一种是不致病的；(2)猪嵴病毒病毒载体达到一定值时才会导致猪嵴病毒；(3)只有与其他肠道病原并存时，猪嵴病毒才存在致病性；(4)猪嵴病毒只是一种肠道寄生病毒，不会对宿主产生任何影响。猪嵴病毒尚未能实现体外分离培养，这很大程度上限制了对于这个新病毒生物学特性和致病性等的进一步研究。根据科赫法则，我们需要更多的研宄，包括寻找猪嵴病毒体外培养敏感细胞系、流行病学数据等，以确定猪嵴病毒对猪是否具有致病性，以及它和猪腹泻的关系。9’ 万方数据在本研究中将受检猪群分为四个年龄段(哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、成年母猪)，数据分析显示哺乳仔猪和猪嵴病毒感染具有显著相关性，来自匈牙利、上海、美国、巴西的研究也指出幼龄动物对猪嵴病毒更易感，这可能是由于幼龄动物的免疫反应系统尚不完善或者是其它年龄固有的因素造成的。本研究中不考虑猪嵴病毒在成年母猪中的感染率，猪嵴病毒在猪群中的感染率随着宿主年龄的增长而上升(哺乳仔猪、保育猪、育肥猪)，匈牙利、韩国、美国、巴西、日本的猪群中也出现了类似的情况，此外，在捷克斯洛伐克，猪嵴病毒在保育猪和哺乳仔猪的总感染率也高于育肥猪Ⅲ，46，50巧21。猪嵴病毒感染和宿主年龄可能有一定的相关性，最终仍需要更多的猪嵴病毒流行病学调查数据来探明这个问题。本研究中猪嵴病毒在母猪中的感染率(40．O％)远低于捷克学者Dufkova等【52J报道的99％，但是高于巴西Barry等151峙艮道的11．8％。母猪群中猪嵴病毒的低感染率可能是由于感染无效造成的，高感染率则可能是因为带毒仔猪引起的感染。不管是哪种情况，这些被猪嵴病毒感染的母猪都会作为猪嵴病毒病毒储藏器，不断对仔猪造成持续性感染。嵴病毒存在于多种动物中，在匈牙利野猪粪便中，嵴病毒的检出率为100％(10／10)[741。本研究中的藏猪粪便中，没有检出猪嵴病毒(0／4)。可能猪嵴病毒在藏猪中的感染情况不像在家猪中那么普遍，且4只健康的育肥藏猪并不能反映猪嵴病毒在藏猪中的真实感染情况，我们需要更多样本才能确定猪嵴病毒在藏猪群中的感染情况。文中构建的系统进化树包括在本研究中获得的35个猪嵴病毒VPl基因序列，以及从GenBank中下载的63个参考序列，系统进化树显示了2011．2012年四川地区猪嵴病毒VPI基因分子流行特点。本研究获得的VPl基因序列可以分为四个大群，说明多株猪嵴病毒同时在四川地区流行，上海和韩国之前的报道也揭示了多株嵴病毒的存在146，471。系统进化分析和核昔酸序列相似性分析再次确认了猪嵴病毒VPl基因多样性程度高，这和之前的文献是一致的№621。扩增猪嵴病毒多聚蛋白基因时，使用了含高保真酶的PrimeSTARPremix，并尽量缩短整个反应的时间，以尽量减少扩增过程中造成的碱基突变。根据1190bp猪嵴病毒多聚蛋白序列的序列分析结果，揭示多株猪嵴病毒能同时感染一只猪。在猪体内，同时感染多个型的一种病毒是很普遍的现象，但是作为一个新病毒，在此之前，尚无文献报道多株猪嵴病毒共感染一只猪的案例。在来自巴西的报道中f51]，一份猪血清被24 万方数据怀疑同时感染了多株猪嵴病毒，序列分析结果显示只有一株猪嵴病毒，可能是由于在PCR扩增和序列分析时，选取的是猪嵴病毒相对保守的基因(3D基因)。在本研究中，PCR扩增的区域包括猪嵴病毒变异最大的VPl基因，在两只猪的粪便中分别检出3株和2株猪嵴病毒共同感染，首次为多株猪嵴病毒共感染一只猪提供了正式证据。从系统进化树中可见，序列AI、A2、A3(来自于样本A)和B2(来自样本13)属于同一个分支，而B2和B1却属于不同的分支，说明猪嵴病毒基因序列的多样性不仅存在于不同个体之间，也存在于同一宿主内。本研究中只对部分样品进行了检测，鉴于猪嵴病毒在猪群中普遍存在，若对更多样品进行检测，我们可能会发现更多共感染的猪嵴病毒株。重组事件的发生在病毒基因组的进化中担任重要的角色，是产生新基因型病毒和病毒变异株的主要驱动力之一。通过重组软件分析，来自同一猪的三个序列(A1、A2、A3)之间观察到了显著的重组现象。两株亲本株同时感染一个宿主是发生重组的先决条件，一只猪同时感染多株猪嵴病毒势必会促进重组事件的发生。本研究分析展示了A2序列中可能存在重组的区域，A2序列的VPI区段可能是由于A1和A2之问发生重组产生的。重组的发生会推动宿主内基因多样性的产生。与其他微小核糖核酸病毒科成员类似，嵴病毒中重组现象很普遍【75】。Wang[601首次使用Simpiot分析猪嵴病毒基因组，在SH．W-CHN株基因组3’末端区域(8083．8210nt)检测到重组信号。五株人爱知病毒全基因序列进行Bootscma分析结果和系统进化分析，结果显示，爱知病毒基因组中也存在镶嵌基因【76】。基于猪嵴病毒H023／2009／JP株VPI基因和3D基因序列的系统进化分析显示，H023／2009／JP株可能是来源于猪嵴病毒和牛嵴病毒的自然重组子【48】541。中国学者也在猪嵴病毒GS．1／2012／CH株中检测到了显著的重组信旦一[641‘了。此外，重组事件的发生会改变病毒的基因组，导致的变异可能将某个动物病毒变成具有致病性的病原，甚至突破种间的屏障，在人类中引发感染。猪0脊病毒H023／2009／JP株发生的型问重组说明了嵴病毒属成员具有跨物种传播的可能性。虽然在454份来自于腹泻儿童的粪便中没有检测到猪嵴病毒，考虑到RNA病毒发生重组的几率相对较高，我们不排除嵴病毒属成员会出现人兽共感的可能性【l21。重组事件的发生、环境因素等都可能导致病毒变异株产生，中国学者报道了多株猪嵴病毒变异株的存在。目前，GenBank中有11条来自中国的猪嵴病毒全基因组序列。其．中WUHl，Y-1一CHI，SH—W—CHN，K一11／20t2／CH和K一4／2012／CH这五株基因组，S 万方数据和猪嵴病毒标准株S一卜HUN类似，基因组都包含8210nt(除去多聚A尾巴)㈦n：21：60,“l。与标准株对比，存在六个猪嵴病毒变异株：CH／HNXX．4／2012株2B蛋白区域有30个氨基酸缺失，VPl蛋白区域有一个苏氨酸插入；CH／HZ株基因组为810Int(除去多聚A尾巴)，有一个腺嘌呤碱基插入，在5’UTR缺失了18nt核苷酸，2B区域缺失了90nt；GS．1／2012／CH和GS．2／2012／CH基因组长812Int(除去多聚A尾巴)，在2B区域都缺失了90nt，在3’UTR有一个核苷酸插入，并且3C／3D的预测剪切位点是Q／C(S．1．HUN株中是。／S)；猪嵴病毒XX株和swKoVCH441基因组全长分别为8147nt和8149nt(除去多聚A尾巴)，都较S一1．HUN标准株短№62，64，771。从2010年底起，中国哺乳仔猪爆发大规模的腹泻，引起这场腹泻的病原不明确，感染仔猪出现呕吐、水样腹泻和脱水症状，发病率约为80．100％，死亡率为50．90％，造成了严重的经济损失。这场腹泻也引发了中国学者对怀疑和猪腹泻有关的新病毒的关注，其中就包括猪嵴病毒。本实验的腹泻病料都是在这场腹泻中收集的，猪嵴病毒的检出率高达64，3％。我国其他省份的学者也对这场腹泻中的病料进行了猪嵴病毒的检测，在浙江(60％)、安徽(100％)、江西(59．7％)、河南(80．9％)、湖北(76．8％)、湖南(88．1％)、甘肃(40．1％)等地均有较高检出率。有学者猜测，猪嵴病毒以及大量变异株的出现可能和这场腹泻的爆发有一定关系。猪嵴病毒的致病性、感染范围、流行特点，是否存在人兽共患等尚不清楚，但是我们需要注意的是，和猪嵴病毒关系较近的人爱知病毒会引起人的胃肠炎，牛嵴病毒也和牛腹泻有关，在狗腹泻病料中也检出了狗源嵴病毒‘4，9，30,40,78‘80】。根据很多微小核糖核酸病毒发病机制类推原理，猪嵴病毒可能也是猪肠道疾病的病原，应该引起关注。广泛的流行病学调查研究，以及对来自不同地区的不同猪嵴病毒株进行系统进化分析，能帮助我们了解猪嵴病毒的流行特点和进化情况。此外，积极寻找猪嵴病毒体外培养敏感细胞系是很有必要的，实现猪嵴病毒体外培养会促进更多快速、准确的检测方法的发展，也能帮助我们了解猪嵴病毒的病原性特点。 万方数据第二章猪嵴病毒VPl基因生物信息学分析与蛋白优势抗原表位区域的原核表达1材料和试剂1．1实验试剂2xTaqPCRMasterMix、DNAMarkerlII购白天根生物；pMDl9一TSimpleVector、SolutionI、限制性内切酶EcoRI、1哳nd脚等购自宝生物工程(大连)有限公司；异丙基一p—D一硫代半乳糖苷(Isopropyl—p—D—thiogalatopyranoside，IPTG)、HRP标记的兔抗猪lgG购自北京博奥森生物技术有限公司；ECL发光液为密理博公司产Y。(ImmobilonwesternchemiluninescentHRPsubstrate)；组氨酸标签融合蛋白纯化柱购自通用电气医疗集团；显影粉、定影粉，均购自天津市世纪奥博商贸有限公司；其余试剂均为国产分析纯。1．2实验器材AX．IIX射线摄影暗匣127minxl78mm，购自广东粤华医疗器械厂有限公司；柯达医用x射线胶片，购自锐珂医疗器械有限公司；超声波细胞粉碎机和隔音箱，均购自宁波新芝生物科技有限公司。1．3溶液及配置SDS—PAGE电泳相关试剂：10％SDS溶液：109SDS用双蒸水溶解后加浓盐酸调节pH至7．2，终体积为100mL；5×Tris．甘氨酸SDS．PAGE电泳缓冲液：准确称量949甘氨酸和15．19Tris，用量筒量取50mL10％SDS(pH7．2)，混合后，用适量双蒸水溶解定容至1L；1MTris—HCl(pH=6．8)：将12．IgTris3JIZ,80mL双蒸水中，待充分溶解后用浓盐酸调节pH值至6．8，并定容至100mL，室温保存；1．5M"Iris—HCI(pH=8．8)：将18．179加入80mL双蒸水中，充分溶解后用浓盐酸调节pH值至8．8，并定容至100mL，室温保存；30％聚丙烯酰胺：称取2929丙烯酰胺和89N，N’一亚甲叉双聚丙烯酰胺，用适量水溶解后定容至1L，用定性滤纸过滤后，将溶液转至棕色瓶中，4。C保存；’7 万方数据10％过硫酸铵溶液：准确称量O．19过硫酸铵，充分溶解于lmL双蒸水中(为了保证实验效果，一般是现配现用)；12％SDS—PAGE分离胶配方(10mL)：3．3mL双蒸水，4mL30％丙烯酰胺溶液，2．5mL1．5MTris．HCI(pH8．8)，0．1mL10％SDS，0．1mL10％过硫酸铵溶液，0．004mLTEMED；5％SDS．PAGE浓缩胶配方(2mL)：1．4mL双蒸水，0．33mL30％丙烯酰胺溶液，O．25mL1．0MTris—HCI(pH6．8)，0．02mL10％SDS，0．02mL10％过硫酸铵溶液，0．002mLTEMED；5xSDS．PAGE上样缓冲液(5mL)：1．25mL1MTris—HCl(pH6．8)，0．59SDS，25rag溴酚蓝，2．5mL甘油，用5mL双蒸水充分溶解，分装为200IxL／管，并于4℃保存，使用前按101aL／1001aL加入B一巯基乙醇；考马斯亮蓝R．250染色液(200mL)：异丙醇50mL，冰乙酸20mL，双蒸水130mL，O。29考马斯亮蓝R．250粉末，充分溶解后，用滤纸过滤除去颗粒物，室温保存；SDS．PAGE脱色液(200mL)：乙醇10mL，冰乙酸20mL，双蒸水170mL(现配现用)；组氨酸标签融合蛋白纯化试剂：结合缓冲液(500mL30mM咪唑溶液)：Na3P04·12H203．809，NaCI14．619，咪唑1．029，充分溶解后调节pH至7．4，定容至500mL；洗脱缓冲液(500m5000mM咪唑溶液)：Na3P04·12H203．809，NaCI14．619，咪唑17．039，充分溶解后调节pH至7．4，定容至500mL；Western—blot试剂10xTransferBuffer(1000mL)：甘氨酸1449，Tris30．29，用适量双蒸水溶解后，定容至1000mL，常温保存；使用时按如下方案配置：用量筒量取100mL10xTransferBuffer，700rnL双蒸水，200mL甲醇混合后使用；Tris缓冲盐溶液(TBS，1000mL)：将2．429Tris和89NaCI溶于适量双蒸水中，用1N盐酸溶液调节pH至7．6，加双蒸水定容至1000mL；TBST：在TBS中加入Tween．20(终浓度为O．1％)；封闭缓冲液；在TBST溶液中加入脱脂奶粉，使脱脂奶粉终浓度为5％；1．4菌种及载体28 万方数据Ecoli．BL21(DE3)菌种，pET32a(+)原核表达载体由四川农业大学动物生物技术中心保存。1．5阳性血清和阴性血清猪嵴病毒阳性血清：用第一章中RT-PCR方法检测，检出猪嵴病毒为阳性的血清样品，作为本研究中的猪嵴病毒阳性血清使用；猪嵴病毒阴性血清：实验室采集保存的刚出生的小猪血清，经RT-PCR方法检测为猪嵴病毒阴性，作为本研究中的阴性血清使用。2实验方法2．1猪嵴病毒VPl基因生物信息学分析本研究测得的猪嵴病毒多聚蛋白基因序列(GenBank登录号：KFl57951)共1190bp，其中182-943bp(762bp)为猪嵴病毒VPl基因序列。利用在线分析软件SignalP一4．0(http：／／www．cbs．dm．dk／services／SignalP／)对猪嵴病毒VPI蛋白进行信号肽预测；使用在线服务器TMHMMServerv．2．0(http：／／wwav．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／)进行跨膜区分析f】4]；通过在线软件BepiPred1．0Server(http：／／www．cbs．dtu．dk／services／BepiPred／)和BcepredPredictionServer(http：／／www．imtech．res．in／raghava／bcepred／index．html)进行猪嵴病毒VPl蛋白线性抗原表位预测；利用DNAStarLasergene7．1软件中的Protean分析猪嵴病毒VPl蛋白抗原表位、二级结构以及各区段的亲水性、表面可能性等；利用稀有密码子在线预测软件RareCodonCaltor(http：／／people．mbi．ucla．edu／sumchan／caltor．html)对序列进行分析。2．2猪嵴病毒VPl基因优势抗原表位密码子优化与基因合成选择猪嵴病毒VPl基因1-462bp一段优势抗原表位区作为目的片段，将这462bp核苷酸序列送金斯瑞生物科技公司进行密码子优化，并将进行了密码子优化后的核苷酸序列进行基因合成。2．3猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区PCR引物设计与合成根据密码子优化后的猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区核苷酸序列，设计一对扩增引物VPl．F／R，并在上下游引物5’端分别添加限制性酶切位点EcoRl和爿f"d瓜 万方数据预扩增目的片段大小为474bp，引物序列如下：VPl·F：堡坐幽￡GCAGCAGATGACGCCAACGCAVP1一R：△△鱼g!rrTCGCTGGTCGGCGGGACAGA将引物序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。2．4猪嵴病毒VPI蛋白优势抗原表位PCR扩增以合成基因的质粒为模板，用引物VPI．F／R和2xTaqPCRMasterMix扩增猪嵴病毒VPI蛋白优势抗原表位区，PCR反应体系如下(509L体系)：2x'IhqPCRMasterMix250灿ddH2020．8ptLPrimerVPl-F(20pm01)2．0laLPrimerVPl一R(20pm01)2．0uL质粒模板0．2此PCR反应程序如下：95。C预变性2min；95℃变性10s，50。C退火30s，72。C延伸30s，重复30个循环；72。C终延伸5rain。电泳后用Bio．Rad凝胶成像仪观察。2．5猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位克隆测序与鉴定按照第一章方法2．7，回收扩增得到的猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区基因的目的DNA，并将其克隆至pMDl9-TSimplevector，筛选酶切鉴定正确的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，酶切鉴定体系如下(10“L体系)：ddH205．0pL10xMBuffer】．09LEcoR／0．5旺Hindlll0．5uL质粒DNA3．0吐酶切反应条件：37。C水浴1．5h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。2．6猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位原核表达载体的构建2．6．1酶切反应与DNA回收将扩增的猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区基因克隆至pMDI9-TSimplevector，把酶切消化和测序分析正确的重组质粒命名为pMDl9．T-VPl。将含重组 万方数据pMDl9一T-VPI质粒与表达载体pET-32a(+)的DH5Q菌株分别在氨苄LB中扩大培养后，按第一章方法2．8．3中步骤分别抽提质粒，用限制性内切酶EcoRl和Hin删别对pMDl9-T-VPl和pET-32a(+)进行双酶切消化反应，酶切体系如下(309L体系)：ddH，o10xMBU恐rEc0R3Hindlll质粒DNA】2．0I上L3．09L1．59L1．5LLL12．OLLL酶切反应条件：37。C水浴2h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳后，将酶切得到的猪嵴病毒VPI优势抗原表位区基因片段与pET-32a(+)表达载体按照第一章方法2．7回收。2．6．2连接转化与阳性克隆筛选鉴定将经酶切消化后的猪嵴病毒VPl优势抗原表位区基因片连接至酶切消化的pET-32a(+)原核表达载体上，构建猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区原核表达载体pET32一VPl，连接体系(109L体系)：SolutionI5．0pL酶切消化的pET-32a(+)0．5-此酶切消化的目的片段4．5·此连接反应条件：16。C连接6h，连接反应完成后，将连接产物转化DH5a感受态细胞中，并以氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆，具体操作参照参照第一章方法2．8．2。将阳性克隆扩大培养后提取质粒，以限制性内切酶EcoRI和H／n删行双酶切鉴定，酶切反应体系参照本章方法2。5。将酶切鉴定结果正确的重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将构建正确的原核表达质粒命名为pET32a．VPl，将包含该质粒的DH5a菌株命名为DH50t-pET32a—VPl。2．6．3猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位原核表达菌株的构建按照第一章方法2．8．1感受态细胞制备方法，制备表达菌株BL21(DE3)?gg受态细胞，按照第一章方法2．8．2连接转化方法将0．5pLpET32a．VPl质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞中，以氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆，将平板上长出的菌落扩大培养11 万方数据后进行质粒抽提，以EcoRI和Hindlll破酶切鉴定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将酶切鉴定和测序正确的菌株命名为BL21(DE3)一pET32一VPl原核表达菌。2．7BL21(DE3)一pET32一VPl原核表达菌的诱导表达与表达条件优化2．7．1BL21(DE3)-pET32-VPl原核表达菌的培养和诱导表达用接种环挑取BL21(DE3)．pET32．VPl原核表达菌单个菌落，接种到含氨苄青霉素(0．19／L)的LB液体培养基(15mL左右)，37"C摇床振荡培养过夜。各取1001aL过夜培养的菌液，分别加入两瓶lOmL新鲜的氨苄LB液体培养基中，37。C200r／rain振荡培养至菌液OD600约为0．6时，一瓶中加入IPTG(终浓度为lmmol／L)，另一瓶不JJ[IIPTG作为对照组，两瓶菌液于37。C200r／min培养4h；设立转入pET-32a(+)的BL21(DE3)做为空载对照，以相同浓度IPTG诱导表达4h。2．7．2样品处理和SDS-PAGE具体步骤分别取lmLf至IPTG诱导表达和未诱导表达I筝JBL21(DE3)．pET32一VPl原核表达菌菌液与pET-32a(+)空载体诱导表达菌液，80009离-b5min，弃上清，1mLPBS洗涤菌体沉淀，用80此PBS重悬菌体，加入20此5xSDS—PAGE上样缓冲液混匀，在沸水浴中煮10min，12000g离一135min，取上清进行SDS．PAGE。SDS．PAGE具体步骤：(1)将SDS．PAGE垂直电泳制胶玻璃板按照使用说明安装好；(2)配置5mL12％分离胶注入玻璃夹板中，并轻轻加入适量ddH20以将分离胶上缘压平整；(3)待分离胶完全聚合完成后，后将玻璃板间注满5％的浓缩胶(约2mL)，用滤纸小心吸干玻璃夹板中的ddH20，然并在玻璃夹板间插入梳子：(4)待浓缩胶凝固完全后，小心拔掉梳子，将制胶装置转移至I]SDS．PAGE垂直电泳槽中，在电泳内外槽中都倒入Tris．甘氨酸电泳缓冲液；(5)上样：取109L*d备好的样品，缓慢加入电泳孔中；(6)电泳：90V电压将样品电泳至浓缩胶和分离胶的分界线，换用150V，待样品迁移至玻璃板底部，结束电泳；(7)染色与脱色：将聚丙烯酰胺凝胶取出，染色1h左右；染色完成后再在脱色液中脱色至蛋白条带清晰，并使用Bio—Rad凝胶成像系统照相记录。2．7．3原核表达条件的优化用接种环挑取BL21(DE3)．pET32一VPI原核表达菌单个菌落，接种到含氨苄青霉素 万方数据(0．19／L)的LB液体培养基(15mL左右)，37。C摇床振荡培养过夜。取1001aL过夜培养菌液接种于10mL新鲜氨苄液体LB培养基中，37。C200r／min振荡培养，待菌液OD600约为0．6时，分别以不同IPTG浓度(0．2mmol／L、0．4mrnol／L、0．6mmol／L、O．8mmol／L、1．0mmol／L乖11．2mmol／L)诱导表达4h，37。C1609振荡培养，诱导表达完成后采集菌液制样进行SDS．PAGE电泳，以确定最佳IPTG诱导浓度；以上步确定的IPTG浓度进行诱导表达，分别于诱导表达后Oh、2h、3h、4h、5h、6h、7h取样进行分析，以优化诱导表达时间；分别在25。C、30。Cff[137。C条件下，以确定的IPTG浓度和诱导时间进行诱导表达，取样进行分析，确定诱导温度。2．7．4重组蛋白可溶性检测以优化了的重组蛋白诱导表达条件，诱导50mLBL2l(DE3)一pET32．VPl原核表达菌菌液，80009离心10min收集菌体，将菌体用PBS洗涤后用3mL20mMTris—HCI(pH8．0)重悬，把菌液反复冻融3次后在冰浴条件下进行菌体超声波破碎，每次2rain共4次，每次间隔1rain，取lmL经超声波破碎后的菌液于4℃，120009离-t二,5min，分别收集沉淀和上清，沉淀以lmLPBS重悬，分别取80I．tL沉淀重悬液和收集的上清液，加入20此5xSDS．PAGE上样缓冲液混匀，在沸水浴中煮10rain，12000g离一G5min，取上清进行SDS—PAGE电泳分析，观察超声波破碎后上清中与沉淀中目标表达产物的含量，以确定目标表达产物是以可溶性形式存在(上清中)还是以包涵体形式存在(沉淀中)。2．8重组蛋白的大量表达与纯化以优化了的重组蛋白诱导表达条件，诱导400mLBL21(DE3)一pET32一VPl原核表达菌菌液表达，80009离心10min收集菌体，将菌体用PBS洗涤后用20mL30mM咪唑溶液(结合缓冲液)重悬菌体。冰浴条件下进行菌体超声波破碎，2mird次，每次间隔1rain，直至菌液变得清亮为止：4℃12000910min，保留上清，将菌体破碎后上清液用o．459m滤器过滤(为了除去残留的细胞碎片)。按照HisTrapFF组氨酸标签融合蛋白纯化柱使用说明对上清进行纯化，具体操作如下；(1)先将注射器吸满蒸馏水，旋开层析柱顶部堵头，用提供的接头将注射器与层析柱连接，要保持连接处一直有液体以避免引入气泡；(2)除去层析柱底部的堵头，用3．5mL去离子水洗去柱内的乙醇；(3)用至少5mL结合缓冲液平衡柱子，流速控制在1mL／min左右；(4)使用注射器将过滤后的上清缓慢推入层析柱中，为保证纯化效果，上样流速控制在0．2mL／min左右；(5)待上柱完成后，使用l5mL结合缓冲液洗涤11 万方数据层析柱，流速控制在1mL／min左右；(6)用5mL洗脱缓冲液洗脱附着在层析柱中的目的蛋白；(7)洗脱完成后，用5mL结合缓冲液洗涤柱子，再以5mL20％的乙醇平衡柱子，并将柱子保存在20％的乙醇溶液中。2．9Western-bIot检测在用层析柱纯化后的蛋白液中加入5×SDS．PAGE上样缓冲液，在沸水中煮沸5rain制成SDS．PAGE电泳样本，将制好的样品(点两个泳道)和预染蛋白质Marker一起进行SDS．PAGE，电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶取出，将点样的泳道剪切下来，进行Western．blot检测，具体操作如下：(1)根据切下凝胶的大小，剪一张与凝胶大小一致的NC膜和6片滤纸，将凝胶、NC膜、滤纸都浸泡在转移缓冲液中平衡10min；(2)按照步骤装配转移“三明治”：海绵专3层滤纸专凝胶--)NC膜专3层滤纸专海绵，每一层对齐，并除去气泡；(3)将装配完成的转膜装置放入转移槽中，注意将凝胶放于负极面，加入转移缓冲液，将电压调为100V，转膜1h；(4)取出NC膜在TBS‘f溶液中漂洗，以洗去膜上的转膜缓冲液；(5)封闭：将NC膜37。C封闭1h，弃去封闭液，TBST漂洗5次，每次5min；(6)将NC膜小心从中问裁剪开，分别放入用封闭缓冲液l：50稀释的猪嵴病毒阳性血清和相同稀释倍数的阴性血清，37。C孵育】．5h，弃去血清，将膜用TBST漂洗5次，每次5min；(7)加入用1：5000稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，37。C缓慢摇动1h，弃液，TBST漂洗5次，每次5min；(8)将试剂Luminol和PeroxideSolution等体积混合均匀后覆盖在NC膜表面，作用1rain；(9)用事先裁剪好的保鲜膜将NC膜包好，放入暗匣中，在暗室中将X射线胶片覆盖在膜上曝光10s，然后显影1rain、水洗后定影1min。3实验结果3．1猪嵴病毒VPl基因生物信息学分析结果3．1．1猪嵴病毒VPl基因信号肽及跨膜区分析通过SignalP．4．0分析和TMHMM2．0预测，结果显示猪嵴病毒VPI蛋白无信号肽、无跨膜区。3．1．2猪嵴病毒VPl基因抗原表位预测结果3．1．2．1BepiPred1．0Server在线分析结果 万方数据使用丹麦科技大学(CBS)创建的在线软件BepiPred预测猪嵴病毒VPl蛋白线性抗原表位，分析结果显示抗原表位主要集中区域为：1—41aa、58．73aa、77—87aa、109．114aa、123—136aa、147一】57aa、162—167aa、180—187aa、201—207aa和225—248aa。其中1．40aa、81．86aa、124—134aa、148．】56aa、226—236aa抗原指数较高(均大于1，临界值为0．35)。3．1．2．2Bcepred在线分析结果利用Bcepred，选择不同参数对猪嵴病毒VPl蛋白线性抗原表位进行分析，基于蛋白质不同理化性质分析结果见图2．1。综合不同参数预测结果，预测猪嵴病毒VPl蛋白线性抗原表位分布在：1．10aa、15．45aa、48．54aa、73．95aa、97．103aa、121—135aa、139．163aa、220．232aa、240．254aa。AADDANAEPPVSNIETGSATT、TEPRTIFSTTD．XPTPPDTNLQRFFSIYRPIFVNGQDYSVCFTAEAGYTFPLXP、，D州枨AGPGDSLPLLLSCFAYFTADPRvALTFSNPAPYA盯ITIYFAPPGSSPOG盟丛IASMGCFYSVQTSI：PPTSEATIPISIP'LASPLSAIPI_SFFGFSDFkGCHDVVNTTFGTLYIR}ASFOCDVPTTTY]TMTAQL4FGNFCC．}qjPP。APPPLGTSPIPL4AVV—RPK6—RSRIVRQ：“：·一⋯⋯*一⋯～一一——～⋯一一一-⋯一1一一一一一11^加DAmEPPvS眦ETGSATT忡EPRTTFSYT嬲PTPPDTNLQRFFSlYRPJFVNGODYS幅FTA：EAGYTFPLNPVDg'Vk＼：AGPGDSLPLLLSCFAYFTADPRVALTFSNPAPTAACIJI—YFAPPG—SSPOG。!GDTSIASMGCFYSVQTSVPPTSEATIPISIPYASPLSAIPI_SFFGFSDFAGGHD＼WNTTFGTLYIR‘一ASFOGD、，PTTIYIT．klTAQIAFGNTCGWPRAPPPLGISPIP．A．％AVVRPKGRSRIWRQ：“}1AA业△塑E业VSNIEIGSAI!婴l堕!!E§!I丛￡I￡￡21IL塑FsIYRPIFVNGODYSVGFTA}EAC,YITPLXPVDWV“AGPGDSLPLLLSCFAWTADPRIjALTFSNPAPYAACITl、下APPGSSPOGr1——————一一。{GDI$1A蜊GCFYSVQTSVPPTSEATIPISIPTASPLSAIPtSFFGFSDFAGGHDVVNTTFGTLYIR‘AsFoGDvPTTTYI州TAQIAFcNFCGYVPRAPPPLGTSPIPAAAVVRPKGRSRIVRQ”‘‘—。。。。’’—’—————“⋯：‘A^DDAXAEPPVSNIETGSAT'IVPEPRTTFsYTD旧TPPDTXLQRFFSIYRPIFVNGQDYSI’GFTA．；EAGYTFPLNPVDWVA№GP6DSLPLLLSCFAYFIADPRVALIFSNPAPYAAcITl汗APPGSSPQG⋯GDISIAS^|GCF髓VQTSVPPTSEATIPISIPYASPkSAIPLSFFGFSDF^GGHDV州TTFGTLTIRASFQGDVPITTYIⅢTA()I^FGNFCGYvPRAPPPLCTSPIPAA^VVRPKGRSRIVRO⋯：‘AADDANAEPPVSNIFIGSATIVPEPRTTFSTTD．k1PTPPDTNLQRFFSIYRPIFl4NGQDYSVGFTA!EAGYTF孔SPVDgmHCMDSLPLLLSCFAYFTADPRvALTFSNPAP张ACITl盯APPGSSPQG。iGDTSIASjIIGCFYSVQTSVPPTSEATIPISIPlHSPLSAIPLSFFGFSDFAGGIIDV州TTFGTLYIR!ASFQGDvP"TYInlTAQIAFGNFCGYVPRAPPPLGTSPIPAAAYVRPKGRSRIVRQ”’一I⋯，，一～一⋯、．。⋯～⋯⋯⋯～．．=—_=⋯⋯⋯⋯⋯‘¨DD心AEPPVSNIFIGSATTVPEPRTTFSYT脒PIPPI)TⅪORFFSIYRPIFVNGQDYSVGF丁^．5EA6YTFPLNPVDBTANAGPGDSLPLLLSCFAYFTADPRVALTFSNPAPYAACITIYFAP陌SSPqG。6DTSIASMGCFYSI’QTSVPPISFATIPISIPYASPLSAIPLSFFGFSDFAGCHDV、搿TTFGTLYIRjASFQGDVPTITYITMTAQIAFGNFCGTVPRAPPPLGTSPIPAAAV、iRPKGRSRIVRO“●；1AADDANAEPP＼rSNlETGSATTVPEPRTTFSYTDXPTPPDTNLQRFFSIYRPlFVNGO【)YS、。GFrA．EAGYTFPLNPVI)IVI’“AGPGDS]。P1。L1．SCF^YFTADPRVALTFSNPAPYAACITIYFAPPGSSPQGg；6DTSIAsii鬲再oTs、：P『J丙鬲丽面HsPLsAIPLsFFGFsD融GGHD、wTTFGTLYIR^SFQ6D、，PTTTYITMTAqJAr6NF(’Gn，PRAPPPLGTSPIPAAA、fVRP黼RSRIVRQ“图2．1．Bcepred预测猪嵴病毒VPl基因B细胞抗原表位结果(参数a·g依次代表亲水性、柔韧性、表面可接触性、转角、暴露表面、极性、抗原指数)Fig2-I．PredictionofB—cellepitopesofPKoVVPIgenebyBcepredfparametera·gindicateshydrophilicity，flexibility,accessibility,turns，exposedsurface，polarity，antigenicpropensity)3．1．2．3DNAStaF中Protean分析结果 万方数据Protean分析结果见图2—2。抗原指数(AntigenicIndex)较高的区域主要集中在1．43aa、82—89aa、99．105aa、125．136aa、149．156aa、20．1．206aa、227．234aa和243。254aa。柔韧性较高的区域和抗原指数较高的区域基本一致。软件Protean通过Gamier．Robson、Chou．Fasman以及Eisenberg三种不同的方式预测了猪嵴病毒VPl蛋白的二级结构。主要亲水区为1-44aa、125．134aa、244—254aa，其他区段则以疏水区为主。，、～-AIphaRegions+Garnier．RobsonA—l●⋯．‘、，一t—B卜1-．●—■■_l●斟●{—{卜■卜1m●_|■—■—■—H—I_射_．¨-BetaRegiONS—Gamier·RobsonB■III■II一一一II■一I—一I-■一·、、-t^，0。¨；。‘、T——卜+}卜—{—}+_+—+—}_{七一+—————}——吾一—吨H争斗aTumRegions—Gamier·RobsonT鹰《一#§#蒜§#簿嚣誉番§嚣磐蘸蒜#《#，1=、，“，，射一c[卜口—o——斗—．}加——po—们——_[卜——廿廿——o_——_}—～oCodRegions．Gamier．Robson鬟卜—虬——叼——kh————‘叫．Hydr,：3phHCltVPh3t-Kvte-Doohtie’卜■卜_—卜——●——●I-■刚■H———．__．．_———卜●H●—斗—■●—H,AiphaAmphipathicRegions·E{senberg。r|卜—■卜_卜——_|■卜__}——■■—lH●硼————■■●●卜斗卜萱斟-Be[aAmphlpat．hlcRegionsEiseqbergF吨翘鬻》暖争—毋———母—_日吨卜q醯卜q圈————{—盛卜一雹翻心。Fle：¨bleRegions—Karplus—SEhu；z1‘5一磷麓Ii垦固。气。盛。璺护。鹜。。国。。d。。醴。。。盎。盈J。。。。。。。。。，．。。。。。。。．w。。17J6]1k』虹k=^一=：、一=，‰，出：。=：—，、：：且、：刖。s。n。。。P『。b。b¨。“m【Em。图2．2．猪嵴病毒VPl蛋白Protean分析结果Fig2-2．ProteansottwareanalysisresultofPKoVVPlprotein3．1．2．4稀有密码子分析结果通过RareCodonCaltor对猪嵴病毒VPl基因进行稀有密码子分析，分析结果见图+。这段长762bp的核苷酸序列总共包含18个稀有密码子，其中AGA(Arg，精氨酸)2个，GGA(Gly，甘氨酸)2个，GGG(Gly,甘氨酸)3个，CCC(Pro，脯氨酸)10个，ACG(Thr,苏氨酸)1个；此外还出现两处2个连续稀有密码子：CCCGGG和GGGACG。，‘y^·：蒋二7浩0f‘坼{?^7oo嚣噩§、1、‘+_砒．^：～。烈越_ti(；T。，～二7u^。，q，“．J、‘“，‘=。“1‘：，’’^‘一ju≥鬻鬻嚣焉；籍。!翟?薯．，篓≯j麓i嚣篡：爱§黪。譬；爹≥，_～“i?1|≥麓嚣女。蓬蕊i．：?：鬈∞。“。∽5’otj。^囊^二："+j．⋯’。篡辫、L。、z一^’甜oi泓。。￡二’c一’^”≈‘+”戮””麓。c：÷^^io+c够_警：警+≤．兰i；≥善；j?’j!冀。_≯一萎羔。．：嚣j，叠‘j髫；慧善j慧j．i．：：、’：一i?：ij；。、：：jiji；纛i；瑟薹鬻i1i’_巍紧塑篱，算譬叠嚣j譬l≮l裟。+譬薹麓黑篆≮■’聪。。·。¨：r。。二。‘。。：^圈jmino^eia女·iCodoaFfeaueheyOfii；i；；；ice⋯攀j≯?I№⋯登!j+⋯⋯Repeal_edⅢ∽COflIeCUmⅫcCoeon‘。、’；1‘‘AG”G⋯”“⋯⋯。。’‘””’”⋯’⋯。。’‘鬻7磁．．⋯。∞7脶啊j^赢z囊攀“-。1·”：’“”尝怠·、∞毽爨一、一’一7··衄图2-3．猪嵴病毒VPI基因稀有密码子分析结果Fig2-3．ResultsofporcinekobuvirusVPIgenerarecodonsanalysis3．2密码子优化结果36 万方数据通过密码子优化，在保证蛋白质序列不变的前提下，将稀有密码子替换为大肠杆菌表达系统常用的密码子，优化结果见图2-4。tGCAGCAGATGACGCCAAeGCAGAACCGCCGGTCTCCAACATTGAAA(。GGGW?CCGCTACCACGGTGCCGGAACCGCGlACCACGrrTAGTl：ACAeGGA工矗^TCCGACCCCGCCGGACACCAATCTGCAGCGTTTCTT了AGCATCl__ATCGCCCGATTTTTGTGAACGGCCAAGaTTACTCCGTTGGTTTTACCGCGGAAGCCGGCTi虹ACGTTCCCGCTGAACCCGGTCGATTGGGTGGeAAⅪGCGGGTCCGGGTGACTCACTGCCGCTGCTGCTGTCGTGC丁丁1GCA工ATTTCACCGCTGA丁CCGCGCGTTGCACTGACGTTTAGCAA{eCGGCTCCG王ATGCGGCCTGl：ATI：§CCA工C1=A(1可TGCACCGCCGGG王鱼GCTCTCCGCAGGGCGGTGACACCAGlATeGOe霉CCAT{GGGClGCTl_王TACAGCGTTCAAACeTCTGTCCCGCCGACCAGCGAAd《习图2-4．猪嵴病毒Vial优势抗原区密码子优化结果(红色部分发生了碱基替换)Fig2-4．CodonoptimizationresultsofporcinekobuvirusVPlproteinmajorepitoperegion(Theoptimizedregionswereinred)3．3猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位PCR扩增结果公司合成的462bp猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区核苷酸序列被克隆到载体pUC57一simple中，以此质粒(pUC57一simple—VPl)为模板用引物VPl一F／R扩增猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区，将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察到与预期大小一致的特异性条带，约474bp，见图2—5。M：DL2000DNA相对分子质量标准；1：质粒pUC57-simple-VPI；2：阴性对照图2．5．VPl基因优势抗原表位区PCR扩增M：DNAMarkerDL2000；1：PlasmidpUC57·simple—VPI；2：NegativecontrolFig2-5．PCRamplificationofporcinekobuvirusVPlproteinmajorepitoperegion3．4猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位TA克隆与鉴定结果用限制性内切酶＆掀，和胁?栅酶切猪嵴病毒VPl优势抗原表位区与pMDl9-TSimpleVector连接的重组质粒pMDl9一T-VPl，酶切产物经电泳后可见与预期大小相符的两条片段，约为474bp和2692bp，见图2-6。测序结果显示，猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区成功克隆到pMDl9-TSimpleVector中，pMDl9-TSimple37 万方数据Vector携带片段与密码子优化后序列相似性为100％。M：DNAMarkerlII；1：EcoRI和HindIII双酶切pMDl9-T-VPI；2：质粒pMDl9-T-VPl图2-6．pMDl9-T-VPI重组质粒酶切电泳图M：DNAMarkerllI；1：pMDl9-T-VPldigestedbyEcoRIandHindIII；2：PlasmidpMDl9·T—VPIFig2-6．RestrictionEnzymeanalysisofpMDl9-T-vPl3．5BL21(DE3)-pET32-VPl原核表达菌菌株构建将鉴定正确的pET32．VPl重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中，将阳性克隆扩大培养后提取质粒，以EcoRI和Hin绷酶切鉴定，酶切产物电泳后出现两条与预期大小相符的条带，一条约为474bp，一条大于4000bp，见图2．7。M：DNAMarkerⅢ：1：EcoRI和HindIIl双酶切pET32．VPI；2：质粒pET32．VPl图2—7．pET32。VPI重组质粒酶切电泳图M：DNAMarkerlII；1：pET32-VPldigestedbyEcoRIandHindllI；2：PlasmidpET32-VPlFig2-7．RestrictionEnzymeanalysisofpET32一VPI测序结果分析显示，pET32a(+)携带的片段与密码子优化后序列相似性为100％，插入位点正确，构建成功的BL21(DE3)．pET32．VPl原核表达菌菌株可以利用pET32a(+)自身具备的启动予与起始密码，表达出携带His标签的重组融合蛋白。3．6BL21(DE3)-pET32-VPl原核表达菌的诱导表达38 万方数据分别收集经Immol／LIPTG在37℃摇床中诱导表达4h的BL21(DE3)．pET32一VPl原核表达菌菌液与pET-32a(+)空载体，连同未经诱导表达的BL21(DE3)-pET32-VPl原核表达菌菌液，制样后进行SDS．PAGE电泳。未经诱导的BL21(DE3)．pET32．VPl原核表达菌只见大量菌体蛋白存在，无明显的重组蛋白表达；经IPTG诱导后的pET-32a(+)空载体在20KDa左右可见明显重组蛋白条带；经IPTG诱导表达后的BL21(DE3)-pET32。VPl原核表达菌在30。40KDa间(目的蛋白大小约35．6KDa)可见明显的重组蛋白条带，见图2．8。KDa、I】23M：标准蛋白质分子量；1：IPTG诱导pET32a(+)空载；2：未诱导BL21(DE3)-pET32-V-P1；3：IPTG诱导BL21(DE3)一pET32一VPl图2．8．BL2I(DE3)．pET32．VPl原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳图M：ProteinMarker；1：IPTG-inducedpET32a(+)vector；2：UninducedBL21(DE3)-pET32-VPlcontrol；3：／PTG-inducedBL21(DE3)一pET32一VPlFig2-8．SDS—PAGEanalysisofBL21(DE3)-pET32·VPlprokaryoticexpressionprotein3．7BL21(DE3)-pET32-VPl原核表达条件优化结果分别以IPTG终浓度为0mmol／L、0．2mmol／L、0．4mmol／L、0．6mmol／L、O．8mmol／L、】．0mmol／L和1．2mmol／L诱导BL21(DE3)．pET32一VPl在37"C1609振荡培养4h，结果表明，未加IPTG时仅可见大量菌体蛋白，没有重组蛋白表达，O．2—1．2mmol／L这五个不同IPTG浓度实验组的蛋白表达量随着浓度的上升没有明显变化(见图2．9)，故选择0．2mmol／L作为BL21(DE3)一pET32．VPI原核表达时IPTG浓度。39鲫∞如鲫∞如驰如塔如，-ll 万方数据345678⋯⋯“麓+≈一∞。{*#≈。姆女％c一⋯ⅫM⋯≈镕二i蓑。二藏赫瓣赫赫赫M：标准蛋白质分子量；1：IPTG诱导pET32a(+)空载；2-8：IPTG终浓度分别为0mmol／L、0．2mmol／L、0．4mmol／L、0．6mmol／L、0。8mmoi／L、i．0mmol／L和1．2mmol／L时BL21(DE3)一pET32一VPl诱导表达产物图2．9．不同浓度IPTG诱导BL21(DE3)．pET32．VPI原核表达SDS—PAGE电泳图M：ProteinMarker；1：IPTG-inducedpET32a(+)vector；2—8：BL21(DE3)一pET32-VPlprokaryoticexpressionproteininducedby0mmol／L，0．2mmol／L，0．4mmol／L，0．6mmol／L，O．8mmol／L，1．0mmol／L和1．2mmol／LIPTGrespectivelyFig2-9．SDS-PAGEanalysisofBL21(DE3)一pET32一VPIprokaryoticexpressionproteininducedbydifferentIPTGconcentration以终浓度为0．2mmol／L的IPTG诱导BL21(DE3)-pET32．VPl进行表达，分别于诱导后0h、2h、3h、4h、5h、6h、7h收集菌体，进行SDS．PAGE电泳分析。结果显示诱导0h时，可见少量茵体蛋白且无重组蛋白条带出现，2—4h，随着诱导时间增加，重组蛋白表达量也逐渐增加，到4．7h时，重组蛋白表达量无明显增加，诱导时间的增加会导致次级代谢产物的增多，故选择诱导4h作为BL21(DE3)一pET32．VPl原核表达最佳诱导时间，见图2．10。以IPTG终浓度为0．2mmol／L，将BL21(DE3)-pET32．VPl在25。C、30"C、37℃三个温度环境中分别中诱导表达4h，结果显示37。C摇床中表达蛋白量高于25℃和30℃，故以37"C作为BL2I(DE3)．pET32一VPl原核表达最适诱导温度。3．8BL21(DE3)-pET32-VPI原核表达重组蛋白可溶性检测以IPTG终浓度为0．2mmol／L，将50mLBL21(DE3)一pET32．VPl原核表达菌液在37。C1609诱导表达4h，离心后收集的菌体用20mMTris—HCI重悬，反复冻融三次后将菌体用超声波破碎，将上清和沉淀分别制样进行SDS．PAGE分析。重组表达蛋白都集中上清中，BL21(DE3)．pET32一VPI原核表达重组蛋白为可溶性蛋白，见图2—11。40⋯⋯鬻鐾篝瑟一一一 万方数据M：标准蛋白质分子量；1：IPTG诱导pEt32a(+)空载；2：未诱导BL21(DE3)一pET32-VPl；3-9：诱导时间分别为0h、2h、3h、4h、5h、6h、7h时BL21(DE3)．pET32．VPl原核表达产物图2．10．BL21(DE3)．pET32．VPI原核表达不同诱导时间产物SDS．PAGE电泳M：ProteinMarker；1：IPTG—inducedpET32a(+)vector；2：UninducedBL21(DE3)-pET32一VPlcontrol；3—9：BL21(DE3)-pET32-VPlprokaryoticexpressionproteininducedbyIPTGatOh，2h，3h，4h，5h，6h，7hFig2-10．SDS—PAGEanalysisofBL21(DE3)-pET32一VPlprokaryoticexpressionproteininducedbyTPTGatdifferenttimeKDa26016011080o¨504030201510=、I12345M：标准蛋白质分子量；1：IPTG诱导pET32a(+)空载；2：未诱导BL21(DE3)一pET32一VPl；3：1PTG诱导BL21(DE3)．pET32．VPI；4：BL21(DE3)一pET32．vPl诱导表达产物破碎上清；5：BL21(DE3)．pET32．VPl诱导表达产物破碎沉淀图2．】1．BL2l(DE3)．pET32．VPI原核表达蛋白可溶性检验M：ProteinMarker；1：IPTG—inducedpET32《+)vector；2：UninducedBL21(DE3)·pET32·VPlcontrol；3：IPTG-inducedBL21(DE3)一pET32-VP1；4：UltrasonicdisruptionspemateoflPTG—inducedBL21(DE3)-pET32一VPI；5：UltrasonicdisruptionprecipitateoflPTG—inducedBL21(DE3)-pET32·VPIFig2-11．SolubilityDetectionofBL21(DE3)-pET32-VPlprokaryoticexpressionprotein3．9BL21(DE3)-pET32一VPI原核表达重组蛋白的纯化4l 万方数据将BL21(DE3)．pET32．VPl原核表达菌扩大培养后，在37。C1609以IPTG终浓度为0．2mmol／L诱导表达4h，收集菌体用结合缓冲液重悬，反复冻融三次后用超声波破碎菌体，将超声波破碎后上清经0．45pm的滤膜过滤后，用GE公司组氨酸标签融合蛋白纯化柱进行纯化。SDS．PAGE电泳结果显示，超声波破碎后的上清中含有大量重组表达蛋白，同时也存在大量杂蛋白，上清液过柱后的洗脱液中保留了重组表达蛋白，且未见明显菌体杂蛋白条带，显示重组表达蛋白纯化结果理想，可用于进一步实验中。如图2—12。KDa、I】2M：标准蛋白质分子量：1：BL21(DE3)．pET32．VPI诱导表达产物破碎上清；2：纯化后的重组表达蛋白图2．12．纯化的重组表达蛋白SDS．PAGE电泳M：ProteinMarker；1：UltrasonicdisruptionspernateofIPTG—inducedBL21(DE3)。pET32一VPl；2：PurifiedrecombinantexpressionproteinFig2-12．SDS—PAGEanalysisofpurifiedrecombinantexpressionprotein3．10重组表达蛋白Western-bIot检测结果以猪嵴病毒阳性血清为一抗，将纯化后的重组表达蛋白进行Western—blot检测，结果显示在30．40KDa间目的蛋白处出现反应条带，猪嵴病毒阳性血清与重组表达蛋白发生特异性免疫反应，重组蛋白具备良好免疫反应原性。42拍Kn86I，一43 万方数据KDa)I1M：标准蛋白质分子量；1：纯化后的重组表达蛋白；2：猪嵴病毒阳性血清；3：猪嵴病毒阴性血清图2．13．重组表达蛋I兰tWestern-blot检测M：ProteinMarker；l：Purifiedrecombinantexpressionprotein；2：PKoVantibodypositiveserum；3：2：PKoVantibodynegativeserumFig2-13．Western·blotanalysisofpurifiedrecombinantexpressionprotein4讨论分析抗原表位是抗原分子中被免疫细胞识别、与免疫细胞表面抗原受体结合、诱导特异性免疫应答的最基本结构和功能单位；在机体的免疫系统中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质分子，其仅识别抗原分子上的抗原决定簇，也就是说抗体的特异性是针对抗原表位而不是针对完整的抗原分子的；抗原表位有两种分类方法：(1)按与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位；(2)按表位结构不同可分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位，前者又称为线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成；后者又称为构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上步连续的氨基酸组成；抗原表位是蛋白质抗原性的物质基础，开展针对抗原表位的研究对疾病的诊断以及分子疫苗的研究等具有重要意义‘81培81。本研究中为了建立一种针对猪嵴病毒抗体的血清学检测方法，将猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区在大肠杆菌表达系统中进行原核表达，并将纯化的重组蛋白作为后续实验的基础。VPl蛋白是嵴病毒的主要结构蛋白，为嵴病毒暴露在最外面的衣壳蛋白，也是和中和抗体结合的主要蛋白。一般情况下筛选抗原表位时，首选应该是具有相对保守表位的优势免疫蛋白基因。在上一章中获得的四川地区35个猪嵴病毒VPl基因序列，核苷酸相似性为80．7％．100％，氨基酸序列相似性为87．2％．100％，说明四川地区流行的多株猪嵴病毒其VPl区域氨基酸序列还是相对保守的。此外，同43O00O0O强托n86Ir。432” 万方数据是微小核糖核酸病毒科成员的口蹄疫病毒(FMDV)，与猪嵴病毒病毒粒子构造相似，无囊膜，核衣壳呈二十面体对称，FMDV有四种结构蛋白，变异程度大小为：VPI>VP3>VP2>VP4，VPI位于病毒粒子的表面，是口蹄疫病病毒最重要的结构蛋白，目前已经通过实验证明FMDV各个亚型(包括0型、A型、C型、AsiaI型等)在VPl蛋白区域都集中了主要的中和抗原位点，VPI蛋白上还包含病毒受体结合区，根据病毒已知抗原表位，预测具有相似结构病毒的表位，也是预测抗原表位的方法之一f73，89’921。我们猜测，猪嵴病毒VPl蛋白和其结构类似的口蹄疫病毒VPl蛋白一样，存在相对保守的线性抗原表位，故本研究选择猪嵴病毒VPl蛋白来开展后续的研究。本研究通过BepiPred、Bcepred、DNASmr中Protean来预测猪嵴病毒VPl基因(762bv，254aa)的抗原表位。BepiPred结合氨基酸的性质(包括亲水性、柔韧性、表面可及性、暴露表面、转角)和隐形的马尔可夫模型(HMM)来预测B细胞线性表位，与那些仅依赖单一氨基酸性质的预测方法相比，BepiPred预测结果的准确性有一定提高。Bcepred也是结合氨基酸的理化性质来预测B细胞线性抗原表位的，主要包括亲水性(Hydrophilicity)、柔韧性(Flexibility)，极性(Polarity)和暴露表面(Exposedsurface)。Protean根据不同的算法和参数，展示了猪嵴病毒VPl蛋白的二级结构、亲水性区域、柔韧性好和抗原指数高的区域、以及表面可能性。综合多种抗原表位预测软件的结果，能在一定程度上提高预测的准确性。BepiPred预测猪嵴病毒VPl蛋白的抗原指数较高的区域为：1．40aa、81—86aa、124．134aa、148．156aa、226—236aa，主要集中在前l56aa中。Bcepred预测猪嵴病毒VPI蛋白线性抗原表位分布在：1—10aa、15—45aa、48—54aa、73．95aa、97．103aa、121．135aa、139．163aa、220—232aa、240—254aa。蛋白质的二级结构与表位的分布有一定联系，B一折叠和旺．螺旋的化学键较高，结构规则较稳定不容易变形，多位于蛋白质内部，较难嵌合抗体，而D一转角和无规则卷曲为凸出结构，多位于蛋白质表面，更可能成为抗原表位；亲水性氨基酸多位于表面；柔韧性好的蛋白，其多肽链有一定活动性，成为抗原表位可能性大。综合各种因素，我们选择抗原表位较集中的前半段(】．462bp)作为猪嵴病毒优势抗原表位区。通过稀有密码子分析软件，发现猪嵴病毒VPI基因稀有密码子含量较高，且存在连续的稀有密码子，这可能会导致其在大肠杆菌表达系统中的表达量过低或者蛋白合成被提前中断阮9们。在本研究最初，猪嵴病毒VPl基因全长以及部分区域进行克隆和原核表达载体构建，并使用BL21的衍生菌Rosetta表达菌表达重组蛋白，Rosetta44 万方数据表达菌补充了大肠杆菌缺乏的7种(AUA，AGG,AGA，CUA，CCC，GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA，能有效提高外源基因在原核系统中的表达水平，但是通过SDS．PAGE分析，结果显示没有目的重组蛋白条带，或者表达量极低，通过SDS—PAGE肉眼看不出已经表达了。我们又尝试使用pET21a(+)、pET28a(+)、pET30(+)、pGEX一6P-】、pGEX．4T-2替换原有pET32a(+)表达载体，并摸索表达的温度、时间、表达所用培养等，结果显示均无目的重组蛋白表达。考虑到mRNA的二级结构对蛋白的合成也有重要影响，我们将猪嵴病毒VPI基因1．462bp片段送金斯瑞公司进行密码子优化，该公司的专利软件GenScript’SOptimumGeneⅢ能在不改变氨基酸序列的前提下对密码子进行优化，将稀有密码子变成大肠杆菌使用频率较高的密码子，并对序列的GC含量，mRNA的二级结构、稳定性等进行优化，以提高蛋白的表达水平。将合成的462bp基因片段克隆都pET32a(+)载体中，以BL21(DE3)作为表达菌，成功表达出猪嵴病毒VPl蛋白主要抗原表位区，并通过对诱导表达的温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化，摸索出重组蛋白表达量最大时的条件组合。将诱导表达后的重组菌用超声波破碎菌体，对上清和沉淀分别进行SDS．PAGE电泳分析，结果显示重组蛋白存在于上清中，以可溶性形式存在，重组蛋白在上清中可以保持其二级结构和天然构象。亲和纯化是重组蛋白纯化较常用的方法，pET-32a(+)表达载体上携带的His基因与重组蛋白融合表达，将超声破碎后的上清通过填充了Ni的柱子进行亲和层析纯化，得到了纯度较高的蛋白；以猪嵴病毒阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗猪lgG作为二抗进行Westernblot检测，结果显示该蛋白能和猪嵴病毒阳性血清发生反应，表明该蛋白具有较好的反应原性。本章研究这为下一步建立猪嵴病毒抗体检测问接ELISA方法奠定了基础。 万方数据第三章猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方法的建立与初步应用1材料和试剂1．1实验试剂TMB底物溶液，购自天根生化科技有限公司；吐温20(化学纯)，购自成都市科龙化工试剂厂；其余试剂如脱脂奶粉、BSA、明胶等为进口或国产分析纯。1．2实验器材96孔可拆酶标板，为Nunc公司产品：iMarkMicroplateAbsorbanceReader(酶标仪)，为美国BIO．RAD公司产品；SmartSpecPlusSpectrophotometer(核酸蛋白仪)，为美国BIO—RAD公司产品。1．3溶液及配置大肠杆菌裂解液上清：将含有pET-32a(+)-VPl质粒的BL21(DE3)按照诱导表达菌的方式进行培养(不加IPTG)，培养约6h后，收集菌体，将菌体用PBS进行洗涤后，再悬浮于1／20体积的PBS溶液中，将重悬后的菌体在冰浴条件先进行超声波破碎，4=C120009离心10min，收集上清备用。包被缓冲液(O．05M，pit9．6碳酸盐缓冲液)：碳酸钠Na2C031．599，碳酸氢钠NaHC032．939，充分溶解后调pH为9．6，加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后备用；洗涤缓冲液(0．15M，pH7．4PBST缓冲液)：KH2P040．29，NaCI8．09，KCl0．29，Na2HP04·12H202．99，充分溶解后调pH至7．4，加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌，使用前加入O．05％的Tween．20：稀释液：Ktt2P040．29，NaCI299，KCIO．29，Na2HP04·12H202．99，PEG6000409，充分溶解后调pH至7．4，加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌备用；血清稀释液：将大肠杆菌裂解液上清与稀释液按l：25比例混合，作为血清稀释液备用；封闭液(5％脱脂奶粉溶液)：59脱脂奶粉溶解于100mLPBST中；终止液(2MH2S04溶液)：将22．2mL和177．8mL双蒸水(注意要缓慢滴加，并不断搅拌)；1．4血清样品46 万方数据猪嵴病毒阳性血清：经RT-PCR检测为猪嵴病毒阳性，且能在WesternBlot检测中与猪嵴病毒VPl重组蛋白发生特异性反应的血清，作为本研究中猪嵴病毒阳性血清使用；猪嵴病毒阴性血清：经RT-PCR检测为猪嵴病毒阴性，且能在WesternBlot检测中，不能猪嵴病毒VPI重组蛋白发生反应的血清，作为本研究中猪嵴病毒阴性血清使用；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)标准阳性血清由本实验室保存。2实验方法2．1纯化重组蛋白浓度测定测得纯化重组蛋白溶液在280nm和260nm波长下的光吸收值，蛋白浓度(mg／mL)=(1．45×A280—O．74xA260)×稀释倍数。2．2间接EL|SA方法的基本操作程序猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方法按如下步骤(优化后按最优条件操作)：(1)包被抗原：用包被缓冲液将纯化的重组蛋白进行稀释，包被96孔酶标板，每孔1001JL，4。C过夜：弃液，以PBST洗板三次，每次5min；在滤纸上拍干；(2)封闭：每孔200btL封闭液，37。C封闭2h；弃液，以PBST洗板三次，每次5min；在滤纸上拍干；(3)加入样品：将待检血清稀释液稀释到一定浓度后，1009L／孑L，37oc99育1h；弃液，以PBST洗板三次，每次5min；在滤纸上拍干；(4)加入酶标二抗：将ItRP标记的兔抗猪IgG用稀释液稀释到一定浓度后，】00}IL／孔，37。C孵育45rain；弃液，以PBST洗板三次，每次5min；在滤纸上拍干；(5)显色：100LIL／孔加入显色液，常温下反应10min；(6)终止反应：在反应孔中加入终止液，每孔501JL；(7)用酶标仪测定OD值(使用单波长450rim)。间接ELISA试验最佳反应条件判定标准：选取P／N值最大，且阳性血清OD450nm平均值在1．0附近(酶标仪在OD值为1．0时反应最灵敏，误差最小)，阴性血清d7 万方数据OD450nm平均值较小的试验条件作为最佳反应条件。每个孔设置两个重复，并设立空白对照孔(以PBS代替血清样品)，P／N=(阳性血清OD450nm平均值一空白对照孔OD450nm平均值)／(阴性血清OD450nm平均值一空白对照孔OD450nm平均值)2．3抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定用方阵滴定法对蛋白包被浓度和血清稀释倍数进行优化。将纯化的重组蛋白用包被液稀释成不同浓度梯度(1599／mL、1099／mL、8jag／mL、699／mL、499／mL、299／mL、0．5Ltg／mL)，100pL／_j：L，4。C包被过夜，用5％脱脂奶粉封闭后，加入按一定倍数稀释的阳性血清和阴性血清：1：40、1：80、1：100、1：160、1：200、1：320，加入酶标二抗(作1：5000倍稀释)，按本章2．1进行ELISA操作。每个孔设置两个重复，并设立空白对照孔(以PBS代替血清样品)，记录OD值=读取OD值平均值一空白对照孔OD值平均值，计算出P／N值，确定抗原最适稀释浓度和血清最佳稀释倍数。2．4抗原包被条件的确定将重组蛋白按最佳稀释浓度稀释，分别在下面四种条件下进行包被：37。C2h；3TC1h+4℃过夜；37。C2h+4。C过夜；4。C过夜，用5％脱脂奶粉封闭，加入按最佳稀释倍数稀释好的阳性和阴性血清，加入1：5000稀释的酶标二抗，按2．1进行ELISA操作，每个孑L设置两个重复，记录结果取平均值，计算出P／N值，确定重组蛋白最适包被条件。2．5封闭液的选择以及封闭时间的确定以确定好的抗原最适稀释浓度和包被条件包被酶标板，分别以1％明胶、1％BSA、5％脱脂奶粉(均用PBST配置)37℃封闭2h，加入最佳倍数稀释的血清，加入1：5000稀释的酶标二抗，按2．1进行ELISA操作，每个孔设置两个重复，记录结果取平均值，计算出P／N值。选定封闭液后，37。C分别封闭30rain、60rain、90min、】20rain，按照EL／SA程序测定OD450nm，每个孔设置两个重复，记录结果取平均值计算出P／N值，确定最佳封闭时间。2．6血清样品最适作用时间的确定用样品稀释液将阳性和阴性血清样品分别稀释至最佳稀释倍数，在37℃分别孵 万方数据育30rain、60min、90min，在其他条件相同的情况下，按优化好的条件和2．2进行ELISA操作测定OD450nm，每个孔设置两个重复，记录结果取平均值，计算出P／N值，确定血清样品最佳作用时间。2．7酶标二抗工作浓度和作用时间的优化用稀释液将HRP标记的兔抗猪IgG(酶标二抗)做一系列稀释：1：2000、l：4000、1：6000、1：8000、l：10000，每孔100pL，在其他条件相同的情况下，按优化好的条件和2．1进行ELISA操作测定OD450nm，每个孔设置两个重复，记录结果取平均值，计算出P／N值，确定酶标二抗最适工作浓度。以上步确定的稀释浓度，37。C分别孵育30min、45min、60min、90rain，确定最适作用时间。2．8底物作用时间的优化按照最适条件包被抗原、封闭、加入阳性和阴性血清，按照优化好的二抗反应条件进行ELISA操作，最后加入显色液TMB溶液，室温下避光分别作用5rain、10rain、15min、20min，每个孔设置两个重复，确定底物最适作用时问。2．9临界值的确定选取40份阴性血清，以优化好的反应条件进行ELISA检测测定OD450nm，计算40份血清的OD450nm平均值(X)和标准偏差(SD)，l艋界值为X+3SD，当待检血清样本OD450nm值大于临界值则判为阳性，小于临界值则判为阴性。2．10特异性实验用建立的ELISA检测方法，对实验室保存的TGEV,PEDV,PRV,CSFV,PPVPRRSV阳性血清进行特异性实验，每个样品设置两个重复。在酶标仪上测出OD450nm值，以平均值确定阴阳性，以确定包被的重组蛋白是否会和其他常见猪病病原的阳性血清存在交叉反应。2．11重复性实验用变异系数来评价批间实验和批内实验重复性，变异系数=标准偏差／平均数，即CV％。SD／X×100％(CV代表变异系数，SD为标准偏差，爿代表平均数)。2．11．1批内重复性实验4q 万方数据用一个批次纯化的重组蛋白抗原包被一个酶标板，取8份不同血清样品按照建立的ELISA检测方法进行实验，每个样品重复4个孔，在酶标仪上测定OD450nm值，将结果进行统计学分析，检验批内重复性。2．11．2批间重复性实验用同一批次纯化的重组蛋白抗原分别包被4个酶标板，在其他条件一样的条件下，按照建立ELISA检测方法对8份血清样品进行检测，在酶标仪上测定OD450nm值，将结果进行统计学分析，检验批间重复性。2．12临床样本的检测采集170份血清样品，用间接ELISA方法进行检测，设立阳性和阴性对照孔。3实验结果3．1纯化重组蛋白浓度测定结果经核酸蛋白仪测定后，纯化后重组蛋白浓度为1．38mg／mL。3．2间接ELlSA检测方法的建立3．2．1抗原包被浓度与血清稀释倍数优化结果纯化后的重组蛋白用包被液分别稀释成：15pg／mL、1099／mL、8pg／mL、699／mL、4pg／mL、2pg／mL、0．599／mL，100uL／孔包被酶标板，阴阳性血清则按照1：40、1：80、1：100、1：】60、】：200、1：320进行稀释。通过方阵滴定ELISA检测，可看到随着包被重组蛋白的减少和血清稀释倍数的增大，OD450nm值不断减小，当抗原包被浓度为21ag／mL，血清为l：200稀释时，阳性血清OD450nm值在1．0左右，且阴性血清OD450nm值也较小(小于O．i)，P／N值较高，故本实验确定抗原的最佳包被浓度为2lag／mL，血清最适稀释倍数为1：200。见表3．1。50 万方数据表3．1．抗原包被浓度与血清稀释倍数的确定Table3-1．Determinationofantigencoatingconcentrationandoptimalserumdilution阳性、阴性血清抗原包被浓度(ffg／mL)稀释倍数15如864210·5+1．9611．9101．87618481．6661．5791．4911．3771：401：801：1001：160】：200l：320P／N+1．2581．0941．0100．9230．7940．8810．7810．6961．5591．7461．8572．0022．0981．7921．9091。9781．8971．7661．6571．6141．5631．4531．2841．238O．892O．754O．678O．587O．4680．432O．387O．3222．1272．3422．4442．7503．3403．3633．3183．8451．7071．4891．3501．2811．2531．2101．2081．1250．4670．3870．271O．2010．188O．1290．1300．1133，6553．8484．9826．3736．6659．3809．2929．9561．5451．3851．2791．2541．2111．1971．1431．0270．3190．283O．2250．1580．1320．1220．1150．1094．8434．8945．6847．9379．t749．8119．9399．4221．2981．1791．1351．1191．0991．0090．9470．876O，2200．2130，1970．1410．1280．097O．095O．0865．9005，5355．7617．9368．58610．4029．96810．1860．8180．794O．7830．757O．7210．718O．610O．5940．088O．083O．0800．079O．0760．0680．064O．0649，2959．5669．7889．5829．48710．5599．5319．281汪了痂日性血清OD450nm值；“一’’为阴性血清OD450nm值；P／N表示阳性血清OD450nm值／阴性血清OD450nm值(下同)3．2．2抗原最佳包被条件的确定将重组蛋白抗原稀释成2pg／mL，100p_L／孑L分别在下面四种条件下进行包被：37"C2h：37。Clh+4。C过夜；37。C2h+4"C过夜；4。C过夜，包被完成后按照程序进行ELISA检测，以确定抗原最适包被条件。将抗原稀释成2pg／mL，血清l：200稀释的情况下，37。C1h+4℃过夜包被条件下所测得P／N较高，故确定37"Clh+4。C过夜为重组蛋白抗原包被条件。见表3—2。表3-2．重组蛋白抗原包被条件的确定Table3-2．Determinationofrecombinantproteinantigencoatingcondition包被条件37*(22h37"Clh+4℃过夜37"02h+4℃过夜4℃过夜阳性血清0．8051．1071．1181．007阴性血清0．0820．095O．1060．099P,qq值9．81711．65310．54710．172-●——_______-__I___l_--___l●_____l-_-___I_-_______--—I___-—_-●—-——__--_——__———-__-_-——————————————一一3．2．3封闭液的选择与封闭时间的确定分别用5％脱脂奶粉、I％BSA、1％明胶在37。C封闭2h，结果表明用5％脱脂奶粉封闭时P／N最大，故选择5％脱脂奶粉作为封闭液。见表3—3。SI洲+一州+一刚+一附 万方数据用5％脱脂奶粉37℃分别封闭30rain、60rain、90rain、120min，封闭完成后按照程序进行ELISA检测，以确定最佳封闭时间。封闭90rain和120min时，P／N值较大，且差异不大，为了节约时间，故选择封闭90rain作为最佳封闭时间。见表3．4。表3-3．封闭液的选择Table3-3．Determinationofblockingbuffer3．2．4最适血清作用时间的确定用样品稀释液将阳性和阴性血清样品分别稀释为1：200，在37。C分别孵育30min、60min、90rain，在其他条件相同的情况下，按照程序进行ELISA检测，确定血清样品最佳作用时间。从结果中可见，孵育60rain和90rain时P／N值差异不大，但较30min时P／N值明显增大，为了提高实验效率，确定温育60rain为血清作用时间。见表3．5。表3-5．最适血清作用时间的确定Table3-5．Determinationofoptimalserumreactiontime3．2．5酶标二抗工作浓度和工作时间的确定将酶标二抗做一系列稀释：1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000，每孑L100pL进行反应，按照程序进行ELISA检测，确定酶标二抗最适工作浓度。结果表明从稀释度1：2000．6000，P／N值不断增大，超过l：8000后，P／N值开始减小，故以1：6000为酶标二抗最适工作浓度。见表3-6。将酶标二抗1：6000稀释后，37℃分别作用30rain、45min、60min、90rain，确定最适作用时间。结果表明作用60min时，P／N值最大，故确定酶标二抗作用时间为60rain。见表3．7。52 万方数据表3-6．酶标二抗最适工作浓度Table3-6．DeterminationofHRPrabbitanti—pigantibodyoptimalworkingconcentration表3．7．酶标二抗作用时间确定Table3-7．OptimizationofHRPrabbitanli—pigantibodyreactiontime3．2．6底物作用时间的优化按照确定好的条件进行ELISA检测，最后加入显色液TMB，室温下避光分别作用5rain、10min、15min、20min，结果显示底物作用15min时，P／N值最大，15min后随着底物作用时间延长后，阴性血清的OD450nm值增大，故以作用15rain作为底q，物最适作用时间。见表3-8。表3-8．底物作用时间的确定Table3-8．DeterminationofoptimalTMBreactiontime底物作用时问5min10min15min20min阳性血清二．，0．843o．9761．0641．179阴性血清P／N值0．0978．69l0．1039．476O．103】0，330O．】】89．9923．2．7临界值的确定用优化好的条件对40份阴性血清进行ELISA检测，结果见表3-9。40份血清的OD450nm平均值(X)为0．125，标准偏差(SD)为0．0415，临界值为万+3SD=0．250，即当待检血清样本OD450nm值大于O．250时则判为阳性，小于0．250则判为阴性。表3．9．间接ELlSA阴阳性临界值的确定Tahie3—9．Determinationofcut0ffvaluefortheindirectELISA3．2．8特异性实验检测结果53 万方数据用优化好的间接ELISA检测方法，对TGEV、PEDV、PRV、CSFV、PPV、PRRSV常见猪病病原阳性血清进行检测，同时设猪嵴病毒阳性和阴性对照，从结果可知，这6种病原的阳性血清均为阴性反应，即不存在交叉反应。见表3—10。表3．10．特异性实验Table3-10．ResultsofspecificitytestoftheindirectELlSA3．2．9重复性实验3．2．9．1批内重复性实验用同一批次纯化的重组蛋白包被一个酶标板，取八份血清进行检测。结果显示，批内重复性实验变异系数在1．16％．5．85％之间，说明同一样品在同一批实验中变异程度小，建立的检测方法批内重复性较好。见表3．11。表3—11．批内重复性实验Table3-11。Repetitiveexperimentswithin-batch3．2．9．2批问重复。|生实验用同一批次纯化的重组蛋白分别包被4个酶标板，在其他条件一样的条件下，按照优化后的间接ELISA检测方法对8份血清样品进行检测。结果显示，批问重复性实验变异系数在1．55％．7．32％之间，均小于10％，表明同一样品在不同批次实验中变异程度小，建立的间接ELISA方法具有较好的批问重复性，见表3．12。3．3临床样本的检测用建立的间接ELISA检测方法对170份血清样品进行检测，结果表明65份为猪嵴病毒抗体阳性，阳性率为38．2％。 万方数据表3—12．批问重复性实验Table3-12．Repetitiveexperimentsbetweenbatches4讨论分析目前猪嵴病毒在猪疾病中的角色尚不明确，但怀疑猪嵴病毒感染可能和猪腹泻有一定联系，因此有必要加强对猪嵴病毒感染情况的监控。国内外学者对猪嵴病毒诊断方法的研究也较多，但都主要集中在普通PCR和荧光定量PCR方法的建立和应用上，本研究建立了一种血清学方法，检测猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA试验作为抗体婀检测方法，与其他血清学诊断方法相比，有很多优点：特异性强、敏感性高、不需无菌操作、短时间内能检测大批样品，适用于实验室诊断和大规模的疫病普查。ELISA反应系统涉及多个组分，每个组分的相关参数都会对整个试验产生很大影响，本研究根据间接ELISA反应的操作流程，对各个步骤中的反应条件进行优化和完善。间接ELISA反应中，抗原的纯度很重要，为提高实验的特异性，应对包被抗原尽可能予以纯化，本研究利用Ni柱对表达产物进行亲和层析纯化，获得较为纯净的目的蛋白。此外，如果抗原中含有能与待检血清或者酶标二抗反应的杂质，也会引起假阳性的发生。本研究的抗原为大肠杆菌表达的重组蛋白，为了尽量减少残留的大肠杆菌蛋白和待检血清反应造成的偏差，在血清稀释液中加入大肠杆菌裂解液上清，降低由大肠杆菌引起的非特异结合。重组蛋白抗原的包被浓度和待检血清的稀释倍数对间接ELISA最后的结果影响很大，重组蛋白抗原包被浓度过高，会由于蛋白分子之间作用力较大造成蛋白分子的多层化，上层的蛋白在洗涤过程中会被洗掉，从而造成蛋白的浪费，也会使本底值增 万方数据高；若是重组蛋白抗原浓度较低，包被酶标板表面可能留下未被抗原吸附的活性表面，从而使得实验的非特异性增高，最佳抗原包被浓度是，既维持一个较低的本底，也能保持测定的灵敏度，此外，待检血清的稀释浓度的确定对结果的准确性和重复性具有重要意义。本研究利用方阵滴定试验确定了抗原的最佳包被浓度为2tag／mL，血清最适稀释倍数为1：200，此时阳性血清OD450nm值在1．0左右，且阴性缸清OD450nm值也较小(小于0．1)，P／N值较高。为进一步降低非特异性反应，本研究还对抗原包被条件进行了摸索，最终确定37℃】h+4℃过夜为最适包被条件。封闭是抗原包被后用高浓度的无关蛋白溶液填充抗原包被后酶标板上未被占据的空隙，1％的BSA、l％的明胶和5％的脱脂奶粉都是常用的封闭剂，脱脂奶粉是一种良好且价廉的封闭剂，本研究最终确定5％脱脂奶粉封闭90min为最佳封闭条件。确定60min为待检血清的最适作用时间，酶标二抗的工作浓度为l：6000，作用时间为60min。TMB无致癌性，在ELISA试验中应用广泛，本研究确定TMB的最佳显色时间是15min。对各个步骤的反应时间进行摸索，可以为了避免因反应时问过短而引起的误差，以及因反应过长而降低了试验结果的敏感性和特异性。此外，本研究根据统计学方法对40份猪嵴病毒阴性血清样品进行ELISA检测，通过统计分析得出阴性样品OD450nm平均值为0．125，标准偏差为0．0415，临界值为0．250，即当待检血清样本OD450nm值大于0．250时则判为猪嵴病毒抗体阳性，小于0．250则判为猪嵴病毒抗体阴性。通过用建立的间接ELISA方法进行交叉反应，表明利用猪嵴病毒VPl重组蛋白建立的间接ELISA方法具有良好的特异性，与TGEV、PEDV、PRV、CSFV、PPV、PRRSV这六种常见猪病病原阳性血清无交叉反应。重复性是决定检测方法应用价值的一个重要指标。本研究中批内重复性实验和批间重复性实验变异系数均小于10％，表明建立的方法具有较好的重复性。本研究利用纯化的猪嵴病毒VPI重组蛋白建立了猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方法，具有良好的特异性、稳定性和重复性，为猪嵴病毒的检测和血清学流行病学调查提供了有效的检测方法。目前尚未猪嵴病毒抗体检测商品化试剂盒，在本研究所有试验结束后，撰写论文时，CNKI数据库中公布了2013年的硕士论文，其中扬州大学田野和河南农业大学姬郭彪‘怕·171，克隆了猪嵴病毒VPl基因，构建猪嵴病毒原核表达载体，并在大肠杆菌表达系统中成功表达出重组蛋白，利用纯化的重组蛋白建立猪嵴病毒抗体间接S6 万方数据ELISA检测方法，其中田野用建立的方法对720份血清进行检测，总阳性率为81．25％，远远高于本研究中的阳性率38．2％，分析造成这种差异可能是由于本研究只表达了猪嵴病毒主要抗原表位区(462bp)，而田野表达的猪嵴病毒VP]蛋白为254aa，实验的灵敏度更高，当然也不排除此差异是由于样品本身及地域等差异造成的。在进一步的研宄中，可将几种检测方法同时应用于同一批样品的检测中，以做出判断。 万方数据结论1．本研究对四川省猪嵴病毒感染情况进行了调查，对四川1株猪嵴病毒VPl基因分子流行病学特点进行分析，丰富了猪嵴病毒病的流行病学数据，为以后的研究提供参考；2．本研究利用软件对猪嵴病毒VPl基因抗原表位进行预测分析，选取抗原表位较集中、抗原指数较高的】-462bp片段，密码子优化后合成基因，定向克隆_至pET32a(+)，构建原核表达质粒pET32．VPl，转化至大肠杆菌BL21中，成功表达出猪嵴病毒VPl优势抗原区重组蛋白；3．利用纯化的重组蛋白，建立猪嵴病毒抗体间接ELISA检测方法，为今后猪嵴病毒血清学检测方法研究奠定了基础。 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万方数据致谢本论文是在徐志文教授的悉心指导和全力帮助下下完成的。感谢导师对我学习和生活上的帮助，在四川农业大学动物生物技术中心学习的三年，在导师的指引下，我成长了很多，获益良多。感谢郭万柱、王小玉等老师在给予我的指导和帮助。感谢一直任劳任怨为我们准备实验器材的张姐。感谢知识渊博、乐于助人的师兄师姐们：周远成、代洪波，廖珊、刘盂良、吴云飞、王潇娣等，感谢你们无私的帮助，你们永远是我学习的榜样。感谢三年来与我一同成长的同学，付梦瑾、韩燕、杨文宇、廖春燕、季宏伟、张辉等，我们相互鼓励、互相帮助，三年同窗情谊，必将成为我们一生难忘的回忆。感谢我的室友和生活中一直关系照顾我的人，你们的陪伴让我使我在迷茫失落时能及时找到方向。感谢父母对我的全力支持。感谢母校以及所有授课老师。66陈蕾2014—5—28 万方数据攻读硕士学位之间发表的学术论文【1】陈,-N-，朱玲，徐凯，等．一株猪源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定[J]．养猪，2011，5：111-112．【2】陈蕾，朱玲，李淞，等．猪嵴病毒VPl基因的克隆及生物信息学分析[J】．中国兽医科学，2012，42(12)：1254-1258．【31陈蕾，朱玲，周远成，等．猪环曲病毒病原特点和流行病学[J]．病毒学报，2013，29(6)：667—672．【4】ChenL。ZhuL，ZhouY，eta1．MolecularandphylogeneticanalysisoftheporcinekobuvirusVP1regionusinginfectedpigsfromSichuanProvince，China[J]．Virologyjournal，2013，10：281．【5】LiD，ChenL，WangC，eta1．AerobicBacterialFloraofNasalCavityofSevenGiantPandas(Ailuropodamelanoleuca)[J]．JournalofAnimalandVeterinaryAdvances，2012，11(16)：3008—3010．[61WangY，ChenL，WangC，eta1．IsolationAndIdentificationOfRothianasimuriumFromaGiantPanda，Journalofanimalandveterinaryadvances[J】．JournalofAnimalandVeterinaryAdvances，2014，12(13)：1190-l192．【7】ChenL，ZhuL，ZhouY，eta1．MolecularGeneticsandEpidemiologyofAichivirusC(PorcineKobuvirus)inChina[J】-BritishJournalofVirology，2014，1(1)：36—41．67