猪流产嗜性衣原体病间接elisa抗体检测方法的建立

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1、猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立摘要流产嗜性衣原体(Chlamydophilaabortus，CAB)是引起猪、牛、羊等多种动物流产、死胎、弱胎等慢性接触性疾病的一种重要病原体，孕妇也可感染而发生流产。集约化猪场的CAB感染必须引起重视。建立准确、快速的诊断方法是预防和控制本病的重要措施。本研究根据Genbank上公布的多型性外膜蛋白90(pomp90)基因序列设计引物，应用PCR技术获得CAB四种不同片断大小多型性外膜蛋白90(POMP90)的编码基因，构建重组表达质粒，在E．coliBL21中大量诱导表

2、达，通过纯化及复性后得到纯度高、免疫学活性好的POMP90重组蛋白，并以它们为包被抗原，建立了猪CAB间接ELISA抗体检测方法，探讨了其在猪CAB感染血清学检测中的应用价值。1．根据己知基因序列设计引物，以流产嗜性衣原体CP／12株的总DNA为模板，PCR扩增了四种不同片断大小的pomp90基因，将目的基因与原核表达载体pGEX．KG进行连接，构建重组表达质粒，经测序证实构建成功。2．将构建成功的重组质粒在E．coliBL21高效表达，融合蛋白POMP．GST经纯化、复性后进行Western-blot检测，结果表明四种重组

3、蛋白均具有较强的反应原性。3．分别以纯化后的四种重组蛋白作为包被抗原，经各项条件的优化，建立了间接ELISA抗体检测方法，并对大量的临床血清样品进行了检测。结果表明，该间接ELISA抗体检测方法具有灵敏度高、特异性好、准确等优点，且克服了传统间接血凝试验低灵敏度、判断主观性强等缺点。本研究构建了pomp90基因的原核表达质粒，进行原核表达，以纯化复性后的重组蛋白为包被抗原，建立了猪流产嗜性衣原体间接ELISA抗体检测方法，为进一步开展猪流产嗜性衣原体病的诊断研究奠定了基础。关键词：猪流产嗜性衣原体；多型性外膜蛋白90(POM

4、P90)；诊断：ELISA；抗体华中农业大学2009届硕士学位论文AbstractChlamydophilaabortus(CAB)wasoneoftheimportantpathogenscausingabortionofsow,COWandeweandpregnantwomen．CABinfectioninintensivepigfarmsmustbepaidenoughattention．Developmentofrapidandaccuratediagnosticmethodsistheessentialmeasur

5、eforthepreventionandCOntrolofthisdisease．Inthisstudy,theprimersweredesignedacCOrdingtothepolymorphicoutermembraneprotein一90(pomp90)genesequenceofCABpublishedinGenbankandfourdifferentfragmentsofpomp90genewereobtainedbyPCR．TherecombinantplasmidswereCOnstructedandexpr

6、essedinE．coliBL21，andthereCOmbinantPOMP90proteinswerepurifiedandrenaturated．ApplicabilitiesofthehighpurityandimmunologicreCOmbinantproteinswereexploredandtheindirectELISAmethodsfordetectingtheCABantibodyinSCTaofpigsweredeveloped．1．Fourdifferentfragmentsofpomp90gene

7、wereamplifiedwiththespecificprimersandthetotalDNAtemplateofCABstrainCP／12．TheobtainedgeneswereidentifiedbysequencingafterlinkedtotheprokaryoticexpressionvectorpGEX-KQ2．TherecombinantplasmidswereexpressedintheE．coliBL21，ThefourpurifiedfusionPOMP—GSTproteinshowed900d

8、immunereactivitydetectedbyWestern-blot3．111eindirectELISAmethodsforthedetectionoftheCABantibodywereestablishedusingthefourpurifiedreCOmbinantprot