鲫鱼igm单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接elisa检测方法的建立

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PREPARATIONOFSn町GLE—CHAINFRAGNⅡNTSVARIABLEANTIBODY(scFv)AGAINSTIgMFROMCRUCIANCARPSANDESTABLISHMENTOFANINDIRECTELISAMETHODFORTHEDETECTIONOFANTIBODYT0彳E尺D丸亿删么S日'D足01P丑丑■ByZhangQianSupervisor：Prof．Dr．LiuYongjieAThesisSubmiRedtoNanjingAgriculturalUniversityInpartialFulfillmentofTheRequirementsfortheMasterDegreeofAgronomyCompletedinJune2013CommencementinJune2013 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：岔诵列7年名月厶日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密西(请在以上方框内打“√”)学位论文作者(需亲笔)签名：多溺如g年∥月乒日导师(需亲笔)签名：专、1心吻老．、沏J≥年多月华日 目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯．．⋯⋯．．⋯⋯⋯．．．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第一篇文献综述第一章嗜水气单胞菌检测技术研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11嗜水气单胞菌概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1嗜水气单胞菌生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2嗜水气单胞菌血清学分型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11，3嗜水气单胞菌致病因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．4嗜水气单胞茵流行病学及病症⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22嗜水气单胞菌检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22．1常规生化鉴定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22．2选择性培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。32．3分子生物学检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。32．3．1聚合酶链式反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．3．2基因芯片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．3．3核酸探针技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．4免疫学技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42．4．1SPA协同凝集试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．4．2免疫荧光技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．4．3酶联免疫吸附试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52．5其他方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53结语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7第二章单链抗体的制备技术及应用发展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。1ll抗体的分子结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112单链抗体的结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ll3单链抗体的特点和改造类型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯123．1单链抗体的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯123'2单链抗体的改造类型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立4单链抗体的基因来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯125单链抗体的表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯125．1原核细胞表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯125．2真核细胞表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯135．2．1酵母表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．135．2．2哺乳动物细胞表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．135．2．3昆虫细胞表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．145．2．4植物细胞表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．146单链抗体在动物疾病研究中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯146．1应用于靶向载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯146．2应用于抑制病毒复制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯156．3应用于病原菌检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯156．4应用于体内寄生虫的防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯157单链抗体技术发展存在的问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．17第二篇试验研究第三章鲫鱼IGM单链抗体融合基因的构建和表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．211实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯211．1菌种与载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯211．2细胞株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．3主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．4主要仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1杂交瘤细胞株的复苏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2杂交瘤细胞的亚克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2．1饲养细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．2．2有限稀释法筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．232．3杂交瘤细胞总RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．232．4反转录合成cDlNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．242．5可变区基因的克隆及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242。5．1引物设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．5．2单克隆抗体可变区基因的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．25 目录2．5．3PCR产物凝胶电泳回收与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．5．4PCR产物连接转入T-vector⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．262．5．5DH5a感受态细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。262．5．6重组质粒转化大肠杆菌DH5a⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．262．5．7菌液PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．5．8质粒的小量制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．6单链抗体基因(F3a-scFv)的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．6．1拼接F3a-scFv基因的引物设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．6．2重链可变区DNA的准备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．282．6．3轻链可变区DNA的准备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．6．4重叠延伸PCR拼接F3a-scFv全长基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．6．5构建19T／F3a-scFv重组质粒并转化大肠杆菌DH5a⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．302．6．6菌液PCR鉴定并送测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．6．7质粒的小量制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．7pET32a-F3a-scFv重组表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．7．1原核表达载体pET32“+)与重组克隆抗体F3a-scFv的限制性内切酶消化及胶回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。302．7．2连接反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．302．7．3重组质粒转化大肠杆菌DH5a⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．312．7．4阳性克隆质粒的提取及酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．312．8pET32a-F3a-scFv融合蛋白的原核表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．312．8．1感受态细胞BL21(DE3)的制备及重组质粒pET32a-F3a-scFv的转化⋯．．312．8．2pET32a-F3a-scFv融合蛋白的诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．9F3a．scFv生物学活性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．9．1WesternBlotting检测F3a-scFv复性蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．9．2间接ELISA法鉴定F3a-scFv的活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．10F3a-scFv酶标抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。333结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．1杂交瘤细胞的亚克隆与抗体亚类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．2杂交瘤细胞总RNA的提取与反转录合成cDNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．343．3可变区基因VL、VH的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．4重组质粒pMD19T／X的筛选(X为克隆的目的片段)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．5可变区基因的测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体问接El1"$A检测方法的建立3．6单链抗体基因(F3a-scFv)的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．6．1VH．Linker和Liner-Vh的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．6．2F3a-scFv全长基因的拼接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．6．3测序结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．7pET32a-F3a-scFv重组表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．8pET32a．F3a-scFv融合蛋白的诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．9F3a-scFv抗原结合活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．9．1F3a-scFv与鲫鱼IgM的WesternBlotting结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．9．2间接ELISA测定F3a-scFv的活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．10F3a-scFv酶标抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4】4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．414．1scFv基因的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯424．2scFv的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．424．3scFv基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．4scFv蛋白的纯化、复性和浓缩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．5scFv活性的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．45第四章嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯．471实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯481．1实验动物及菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯481．2主要试剂及实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯482实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯482．1全菌抗原的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯482．2血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯492．2．1阳性血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．2．2阴性血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．2．3不同免疫时期鲫鱼免疫血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。492．2．4不同感染时期鲫鱼免疫血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．3间接ELISA实验操作步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯492．3．1全菌包被抗原的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．492．3．2包被⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．3．3封闭⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．50 目录2．3．4加鱼血清(一抗)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．3．5加|Ⅱ姆-scFv(二抗)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯502．3．6显色和终止⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．502．3．7结果判定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．4问接ELISA最佳反应条件的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯502．4．1包被抗原和一抗最佳工作浓度的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．502．4．2抗原最适包被条件的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．512．4．3封闭液和封闭时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l2．4．4一抗血清最佳反应时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l214．5酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．512．4．6显色时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5l2．4．7Cut．off值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l2．5敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯522．6重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯522．6．1批次内重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。522．6．2批次间重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．522．7不同免疫及感染时期鲫鱼IgM抗体水平的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯523结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．523．1间接ELISA最佳反应条件的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯523．1．1包被抗原和一抗最佳工作浓度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．523．1．2抗原最适包被条件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．533．1．3封闭液和封闭时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．533．1．4一抗血清最适作用时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．543．1．5酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．543．1．6显色时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．553．1．7Cut-ofr值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯553．2敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯563．3重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．563．3．1批次内重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．563．3．2批次问重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．573．4不同免疫及感染时期鲫鱼血清抗体水平的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯574讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．58参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60 鲫鱼]gM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．63致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．65 摘要鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立摘要鱼类的免疫系统在抵御病原入侵及感染后疾病的恢复上起到了关键作用。其中，]gM是鱼类特异性免疫应答中最主要的介质。目前，血清抗体效价的高低已经成为反映水生动物免疫水平较为理想和可靠的指标。因此，建立检测鱼类血清中igM的方法，对于深入了解鱼类体液免疫应答的规律，有效监测鱼类疫苗的免疫效果及疾病的感染情况有着重要的意义。单链抗体(scFv)是将抗体的重链、轻链可变区通过一条弹性肽链连接物(Linker)首尾相接组成的重组蛋白，保持着天然抗体的特异性和大致接近的亲和力。其具有分子量小、易于基因工程改造、便于大量生产等优点，因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展前景。本试验对实验室制备和保存的小鼠抗鲫鱼IgM单克隆抗体(mAb)进行了单链抗体的构建。以mAbF3a为研究对象，利用Trizol法提取F3a的总RNA，反转录合成eDNA后，利用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段，利用重叠延伸PCR方法将重链、轻链通过Linker连接起来构建F3a-scFv，并将其插入原核表达载体pET32斫n中构建重组质粒，经测序正确后，阳性克隆转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，SDS．PAGE分析，目的蛋白大小在45kDa左右，主要以包涵体形式存在。对表达产物应用Ni-NSTHis．BindResin进行纯化后，进行脲梯度透析复性，并对其进行超滤浓缩，得到目的蛋白浓度为2．6mg／mL。间接ELISA和Westernblotting证实F3a-scFv复性后具有良好的免疫反应性。为了有效地监测鱼类疫苗的免疫效果及疾病的感染情况，本试验以灭活嗜水气单胞茵为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鲫鱼IgM的单链抗体为酶标二抗，通过反应条件的优化建立了检测鲫鱼血清中IgM抗体水平的间接ELISA方法。实验所确定的间接ELISA最佳反应条件为：包被抗原最适工作浓度为108cfu／mL，最佳包被条件是4℃过夜；一抗(血清)最佳稀释度为1：160；最佳封闭条件是以5％脱脂奶，37℃封闭1．5h；抗原抗体最佳作用时间为I．5h；酶标二抗最佳作用稀释度为1；50，作用时间为lh；TMB底物显色条件为28℃温育10min。以OD450值>O．0963判为阳性，样品OD450值<0．0831时判为阴性，0．0831_<祥-品OD值<0．0963时判定为可疑。敏感性试验显示当血清稀释度达1：2560时，阳性样品检测结果仍为阳性，表明所建立的间接ELISA方法敏感性较好。批次内重复性试验的变异系数在1．2％． 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立5．3％之间，批次间重复性试验的变异系数在1．36％．6。7％之间，均小于10‰表明所建立的间接ELISA方法重复性和稳定性良好。运用已建立的间接ELISA方法检测鲫鱼不同免疫和感染时期血清中]gM抗体的水平，结果显示：免疫组和感染组10d前的血清抗体水平均为阴性，10d开始呈现上升趋势，免疫组在35．40d时血清IgM抗体水平达到最高，而感染组在30．35d时达到最高，此后两组的血清IgM抗体水平开始下降；直到60d时，免疫组IgM抗体水平仍较高，而感染组检测结果也仍为阳性。与感染组和免疫组相比，对照组所有时间点的检测结果皆为阴性。关键词：单链抗体；可变区；嗜水气单胞茵；间接ELISA；IgMII 摘要PREPARATIONOFSn町GLE．CHAINFRAGN虹NTSVARIABLEANTIBODY(scFv)AGAINSTIgMFROMCRUCIANCARPSANDESTABLISHN饪!NTOFANINDIRECTELISAM匣THODFORTHEDETECTIONOFANTIBODYTO彳上王尺012IZ．DM4SH，rD足D尸!月，L4ABSTRACTFishcouldproducethehumoralimnluneresponsemediatedbyimmunoglobulinwhenconfrontedwithsomepathogens．IgMisthemainimmunoglobulininfishthatcaneliciteffectivespecifichumoralresponsesagainstvariousantigens．Theserumantibodytiterhasbecomeamoreidealandreliableindexinevaluatingimmunitylevelinaquaticanimal．Therefore，itisveryimportantfortheestablishmentofmethodstodetecttheIgMlevelinantisera．Single—chainvariablefragments(scFv)isspliced谢tllthevariableregionofheavychain(vH)andthevariableregionoflightchainⅣL)fromendtoheadbyanintroducedflexiblepolypeptideLinker．ScFviscapableofbindingitstargetantigenswithaffinitysimilartothatoftheparentmonoclonalantibody．scFvhassomepotentialadvantagesoverfull-lengthmonoclonalantibodysincetheyaresmaller,economicalandcanbeeasilyamendabletogeneticmanipulation．Inthestudy，weattemptedtoconstructscFvfromthemonoclonalantibodywhichWaspreparedandpreservedinlaboratory．ThetotalRNAWasabstractedfromthehybridomacellwhichWassecretinganti—IgMantibody，andOligodTwasemployedasthereverseprimertosynthesizethefirstchainofeDNA．VHandVLgeneswereamplifiedbyPCR,andthegeneswereclonedintothepMD19Tvectortotestthesequences．Followedsplicingbyoverlapextension，linker(Gly4Ser)4WasleadedinbetweenVHdownstreamandVLupstream，therebygettingtheF3a-scFvgene．ThentheF3a-scFvgenewasrecombinedintheprokaryoticexpressionvectorpET32a．Afteritwasprovedtobecorrectbyenzymedigestionandsequencing，therecombinantplasmidWastransformedintoEscherichiacoliRosetta(DE3)pLysS．SDS-PAGEanalysisshowedtheexpectedproteinbandwitllthemolecularweightof45kDa．TherecombinantproteinWashighlyeffectivelyexpressedwiththeformofinclusionbody．ThentheF3a．scFvproteinWasrenaturatedby4．0mol／Lureagradient．AfterconcentratedbylOkDaMillipore，theconcentrationofF3a·scFvWasupto2．6mg／mL．TheindirectELISAandwesternblottinganalysesdemonstratedthattheIII 鲫鱼IgH单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立recombinantproteinhasgoodimmunoreactivity。TheinactivatedwholecellsofA．hydrophilaWasusedasthecoatedantigenandtheHRPlabeledsingle—chainfragmentsvariableantibody(scFv)agmnstIgMfromcarpserumwasusedassecondaryenzyme-labeledantibody，allindirectELISAWasestablishedtodetecttheIgMlevelsinCruciancarps．Theoptimizedreactionconditionswereasfollowings：theoptimumcoatingconditionswerewith10％fu／mLofinactivatedbacterialcellsovernightat4"C；theoptimaldilutionsofantiseraWas1：160；，5％skinmilkWasusedforblockingat37"Cfor1．5h；theoptimalreactionconditionsoftheantigen—antibodyWas37"C1．5h；thesecondaryenzyme-labeledantibodydilutedin1：50Wasincubatedat37℃forlh；theoptimalincubationconditionofsubstrateWas28'ClOmin．ThecutoffvaluesofOD4s0．mofthepositiveandnegativeserawere0．0963andO．0831．．Therepetitiveexperimentsdemonstratedthatcoefficientsofvariationofinter-plateandintra-platewere1．36％-6．7％and1．2％一5．3％，respectively，showinggoodstability．TheestablishedELISAWasusedtodetecttheIgMlevelsintheimmunizedgroupandtheinfectedgroup，andtheresultsshowedthatIgMinbothgroupsappearedat10dafterimmunizationorinfectionandpeakedduring35·40dand30—35d，respectively，andtheIgMlevelsintheimmunizedgroupwerehigherthanthoseintheinfectedgroup．Keywords：scFv；variableregion；Aeromonashydrophila；indirectELISA；IgMIV 第一篇文献综述第一章嗜水气单胞菌检测技术研究进展嗜水气单胞菌似eromonashydrophila)隶属于气单胞菌科似ermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，为嗜温有动力单胞菌，是气单胞菌中最重要的存在，是气单胞茵的模式种。其分布广泛，并能导致多种哺乳动物、水生动物和其它生物的感染，导致水产动物疾病以及人畜的腹泻、食物饲料中毒，并且是免疫抑制个人肝功能疾病患者的机会致病菌，是典型的人．兽．鱼共患病病原，严重危害水产养殖业和人类的身体健康【l，21。因此，寻求更有效的检测技术和方法对嗜水气单胞菌进行鉴定和研究至关重要。1嗜水气单胞菌概况1．1嗜水气单胞菌生物学特性嗜水气单胞菌是兼性厌氧、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌，有时可呈现双球状或丝状，大小约0．5．1．01an；电子显微镜下可见极生单鞭毛，部分具有侧鞭毛，菌毛丛生，有运动力，生长的pH值为5．5．9．0，最适生长温度为25—30。or3，41。其在普通营养琼脂培养基上生长良好，28℃培养24h后，形成圆形的、边缘整齐、表面湿润、中间略隆起、光滑半透明的、颜色由灰白色至浅黄色的菌落，有特殊气味【卯。在血琼脂平板上10．374C条件下生长旺盛，大多数具有溶血性而形成p溶血环，溶血带宽且通明【61。在麦康凯培养基上生长良好，而在弧菌选择培养基TCBS上以及6％NaCI中不生长。1．2嗜水气单胞菌血清学分型嗜水气单胞菌血清分型比较复杂，血清型呈多样性。国际上有100以上的O抗原血清型【7】，英国学者研究表明03、011、016、017、034是主要血清型，其中011、019、034主要对鱼致病，而011、016、034为人源分离株常见‘8。10】。国内研究表明，多为05、09对鱼致病，而01l、016、034为人源分离株常见【11，121。以上研究的菌株主要来自临床分离和环境分离。目前国内认为引起养殖鱼类爆发性流行病的优势血清型为05和09，其中05的代表菌株为J-1，已成为疫苗制备菌株。1．3嗜水气单胞菌致病因子嗜水气单胞菌的毒力因子与其致病性密切相关，包括外毒素、胞外蛋白酶、各 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立种粘附因子等。外毒素是嗜水气单胞菌重要的致病因子之一，包括气溶素、溶血素、细胞毒素、肠毒素【13】、HEC毒素114，151等。虽然上述毒素的名称不同，但其在结构、功能及生物学活性方面都极为相似【165，而Rose等㈣通过比较不同外毒素的氨基酸序列发现，氨基酸序列有明显的差异。研究表明，作为主要致病因子之一的胞外酶，有的具有直接致病性；而没有直接致病性的，却具有活化其他致病因子的能力【18】。胞外酶种类繁多，其种类和性质随着菌株、培养条件、纯化方法的不同而随之改变【195，所以不同研究人员针对不同细菌胞外酶研究报道的结果也不尽相同。嗜水气单胞菌的粘附因子包括外膜蛋白、S层蛋白、脂多糖和菌毛。其中外膜蛋白是研究的热点，它是嗜水气单胞菌重要的保护性抗原【2们，也与细菌的毒力密切相关【211，其功能和作用也逐步为试验所证实。1．4嗜水气单胞菌感染流行病学及病症嗜水气单胞菌分布广泛，于淡水、污水、淤泥、土壤和人类的粪便中均有发现，主要危害鲢、鳙、鲫等淡水养殖动物。流行水温在9．36℃，以28．32℃为高峰，6．7月易急性爆发【22】，而一冬龄的鱼种和成鱼是易发病群体。嗜水气单胞菌能引发水产动物的赤皮病、穿孔病、烂腮病等【231，细菌性败血症和溶血性腹水症也是其引发的常见疾病；因其发病率和死亡率高，是我国水产养殖业上危害性最强，造成经济损失最为严重的一种急性传染病1241，深受广大研究人员的重视。2嗜水气单胞菌检测方法2．1常规生化鉴定方法致病性嗜水气单胞菌的检测具有国家标准，具体如下：进行细菌的分离后，采用阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、水杨苷、七叶苷五种糖发酵试验，以及吲哚试验、AHM鉴别培养、氧化酶试验进行鉴定，并使用斑点酶联免疫试验和脱脂奶平板进行致病性的鉴定，整个过程需要4—5d。但许多菌株的生化试验结果存在差异，部分菌株试验结果与标准株不符，因此还需要进一步验证。在嗜水气单胞菌生化反应原理上研制简易鉴定试剂盒和细菌鉴定仪，不仅简化了检测程序，而且缩短了反应时间，提高了检测效率。API快速反应板被证实能够鉴定出细菌的种属【2熨。李圆圆等1265使用ATB细菌检定仪快速的鉴定出鲟源致病性单胞2 第一篇文献综述第一章嗜水气单胞菌检测技术研究进展菌X1。2．2选择性培养基鉴定选择性培养基制作容易，使用方便，己成为国外许多鱼病实验室主要的诊断方法。但是此方法对温度和时问的要求较为严格，不够精确。在细菌分离时，对污染的材料可以选用RS选择培养基，效果更为明显【27】。同时，鱼类嗜水气单胞菌的检测可以使用Rimle．Shorts培养基，但时间和温度很重要，嗜水气单胞菌检测温度为37"C，不能低于此温度[28,29】。2．3分子生物学检测方法2．3．1聚合酶链式反应(PCR)PCR方法因其灵敏度高、特异性强、易自动化等特点，已广泛应用于细菌的检测。夏春等【30l采用Nested．PCR方法，建立起检测产B．溶血素嗜水气单胞菌的方法。卢强等【311针对嗜水气单胞菌气溶素基因保守区序列设计引物，建立了检测嗜水气单胞菌的PCR检测方法，可检测最低100efu的细菌。储卫华等吲以鱼源嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因为目的基因建立的PCR检测方法，可检测灵敏度达2．0×1029／L的模板DNA；2005年又以16SrDNA基因序列及气溶素基因序列为模板设计引物，建立了快速检测嗜水气单胞菌的PCR方法【33J。郭松林等【34】以嗜水气单胞菌外膜蛋白和编码溶血素基因序列为目的基因，依其保守序列设计两对相应引物，建立了双重PCR方法检测嗜水气单胞菌。朱芝秀等‘35】以16SrDNA和Aero基因为靶基因设计2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的方法。饶静静等【36l以嗜水气单胞菌16SrRNA、溶血素基因、气溶素基因为目的基因，王远微等【3刀以丝氨酸蛋白酶基因、16SrRNA、气溶素基因为目的基因，分别建立了三重PRC方法检测嗜水气单胞菌。高建忠等‘38，391以嗜水气单胞菌气溶素基因为目的基因，基于TaqMan探针建立起荧光定量PCR检测方法，与传统检测方法、常规PCR方法相比，检测灵敏度更高，速度更快，并表现出良好的特异性。王蓉等[40l利用实时荧光定量PCR技术建立的检测嗜水气单胞菌的方法，结果表明该方法可在半小时左右直接定量检测病人腹泻物或水产品病变部位中的嗜水气单胞菌。2．3．2基因芯片(Genechip)3 鲫鱼igM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接EUSA检测方法的建立基因芯片技术是在特定支持物上标记作为探针的特定基因片段或寡核苷酸序列，依据碱基配对原理，利用基因探针识别基因混合物中特定的基因片段。靶基因一般选择保守性比较强的基因，但此类保守基因只能鉴别属以上水平，对于同种属间的微小差别需要建立新的靶基因；而且该技术只能针对已知的16SrDNA或23SrDNA序列，检测未知序列有难度⋯1。目前基因芯片技术已经应用于水产品及水体病原菌的检测中【42】，但价格较高。2．3．3核酸探针技术(NucleicAcidProbe)核酸探针技术，就是将特定的具有高度特异性的已知核酸片段，加入到变性的待检样品中，该特定的核酸片段能与和它互补的核酸序列进行杂交，从而能够检测出待检样品中的特定核酸序列。利用核酸探针技术对疾病进行诊断的灵敏度和准确性都很高，并具有微型化、高通量等优势。目前，以核酸探针技术为基础的核酸杂交技术已成功应用到了细菌性鱼病的诊断中。但此方法成本高，只能针对已获得特定序列的细菌进行检测，对仪器依赖性强，对其发展有一定局限性【411。2．4免疫学技术2．4．1SPA协同凝集试验(SPA—COAl葡萄球菌蛋白A(SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁的表面蛋白质，具有能与多种动物IgG的Fc片段结合的特性，且不影响Fab片段的活性，因此成为免疫检测技术中极为有用的试剂。SPA协同凝集试验就是利用SPA的特性，在颗粒透明或很小、沉淀不明显的凝集反应中起到载体以及放大的作用，使灵敏度得以提高f43J。此技术已广泛应用于病原微生物的诊断及病原血清型的鉴定中。李学勤Ⅲ】用富含A蛋白的金黄色葡萄球菌与嗜水气单胞菌高免血清混合致敏，使血清吸附到SPA上，建立了快速检测嗜水气单胞菌的SPA．COA，该方法诊断速度快、特异性强、重复性好、敏感度高。王文东等【31】以嗜水气单胞菌兔源高免血清制备得到SPA诊断液，同等条件下敏感性比玻片凝集反应高25—50倍。2．4．2免疫荧光技术(ImmunoflurescenceTechnique)免疫荧光技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。其中荧光抗体技术在实际工作中应用较为广泛，按照荧光素标记对象又可分为直接法(FAT)和间接法(IFAT)两种。目前直接法在水产品的疾病监测中已得到了一定的应用，敏感性强且具有一定的直观性，但因4 第一篇文献综述第一章嗜水气单胞菌检测技术研究进展为要借助荧光显微镜的观察，所以推广受到限制。高汉娇等145J用FAT法证实了鳝鱼细菌性败血症的病原菌是嗜水气单胞菌，检出正确率和检出率高，方法简单快捷；李卫军f471应用IFAT检测出鳟鱼体内的嗜水气单胞菌，该法不会与其他细菌发生交叉反应，操作简便，耗时短；陈昌福【46l用FAT测定出中华鳖体内的嗜水气单胞菌，检出率高，适用于冷冻保存的标本；白雪梅等【48】建立的荧光抗体免疫检测方法成功检测到嗜水气单胞菌。2．4．3酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA是应用最广、发展最快的一项技术，其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。ELISA常用的方法包括：竞争ELISA、双抗体夹心ELISA、间接ELISA、Dot-ELISA、ABS．ELISA等。此方法具有灵敏度高、特异性好、简便快捷、易于自动化等优点，但是前期准备工作较为复杂，且不易商品化，所以在实际应用中的发展推广受到限制。Adams等【49】使用ELISA技术检测实验室内和自然感染鱼组织内的嗜水气单胞菌，结果证实ELISA可检测到103／mL的嗜水气单胞菌，该方法稳定性高、敏感度好，为嗜水气单胞菌的检测提供了新的可行的方法；钱东等【50】成功建立ELISA方法检测细菌性败血症病原为嗜水气单胞菌，检出率高，耗时短；Swain等【51】建立ELISA方法对嗜水气单胞菌及其它细菌进行检测，效果良好；夏君【52】建立间接ELISA和Dot-ELISA方法对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌进行检测，检测符合率为100％。Dot．ELISA与ELISA相似，既有ELISA方法的优点又能克服它的不足，制作好的诊断膜片可在常温下长时间保存，携带方便，结果客观，肉眼易于判断结果，适合大规模生产使用；但不足之处在于特异性不够高、结果判断主观性强等。陈怀青等【53】建立Dot—ELISA法检测嗜水气单胞菌HEC毒素，结果表明其方法比溶血试验敏感度高40倍；刘颖等【54】建立的Dot-ELISA方法重复性强、特异性好，对大量样品的检测在34小时内就能得到结果；沈素芳等【55】利用Dot．ELISA方法研发了鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒，任燕等【56J在鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒基础上，采用Dot．ELISA、脱脂奶平板、双重PCR检测致病性嗜水气单胞菌，结果表明Dot．ELISA法更为敏感实用，可用于实际临床诊断。2．5其他方法日本学者Notomi【571发明的基因恒温扩增新技术——环介导基因扩增法5 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立(LAMP)，该方法灵敏度高、特异性强、耗时短、检测方便，更适合于缺少设备的基层实验室检测病原。程天印等【58】以嗜水气单胞菌气溶素基因为靶基因，建立了LAMP检测方法，结果证明该方法灵敏度高于PCR，应用前景良好。3结语嗜水气单胞菌对水产养殖业危害严重，对其的检测方法和技术国内外均有可借鉴的，但是各种技术方法都存在着各自的局限性。因此结合现有条件设备，选择最适宜的方法或将多种方法结合起来所建立的方案更为可靠；而建立起更为方便快速、适宜推广应用的检测方法仍是今后广大研究者的研发方向。6 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第一篇文献综述第二章单链抗体的制备技术及应用发展抗体是动物机体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的、能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。抗体的主要功能是与抗原结合，从而有效地清除机体内异物，使机体保持正常的平衡和稳定。19世纪末多克隆抗体技术的出现为抗体的研究和发展奠定了基础：Kohler和Milstein在1975年建立了体外淋巴细胞杂交瘤技术，能够产生单克隆抗体(McAb)，该技术的问世，极大推动了人们在抗体理论研究及实践应用上的发展；进入20世纪80年代，随着DNA重组技术的进步和对抗体分子结构研究水平的进一步突破，抗体的研制跨入了基因工程抗体的时代。基因工程抗体在生物学、医学领域具有非常重要的理论和应用价值。其中单链抗体(single-chainantibody，seFv)因其免疫原性小、穿透力强、易于基因工程改造、易于经济有效地生产等特点，比单克隆抗体具有更大的发展优势和前景【11，是目前发展较多、较快的重组抗体之一。l抗体的分子结构上世纪50年代，Poter和Nisonoff提出了免疫球蛋白Y型结构模型。现代研究表明，各种抗体分子在类和亚类上有所不同，但抗体分子具有相似的分子结构，即由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)共4条肽链构成的“Y”字形分子，重链和轻链问以二硫键和分子间作用力维系。根据肽链氨基酸序列变化的程度，重链由可变区(variableregion，VH)和恒定区(constantregion，CH)两部分构成，轻链由可变区ⅣL)和恒定区(CL)两部分构成。重链可变区内有4个区域的氨基酸变异度最大，称为超变区(hyperbariableregion)，其余氨基酸变化较小，称为骨架区(frameworkregion，FR)。轻链可变区内有3个高变区。多肽链分子可折叠形成几个由二硫键连接成的环状球形结构，即功能区(domain)。其中由重链和轻链可变区内的超变区构成抗体分子的抗原结合点，又称为抗体分子的互补决定区(CD黜)【21。2单链抗体的结构seFv是指将抗体的重链、轻链可变区通过人工合成的弹性肽链(Linker)首尾相接构成的抗体，具有与天然抗体中抗原结合位点相似的结构，仍保持着天然抗体的特异性和大致接近的亲和力。其大小通常在25．28kDa，只有整个Ig的1／6(完整Ig约150kDa)[31，是目前具有生物学功能的最小形式的抗体【4】。单链抗体的结构可以分为两种，即VH．Linker-VL和VL．Linker．VH。其中，Linker 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立的作用在于维持重链和轻链可变区功能区的空问构象，使其能够自由折叠，并在折叠后能够正确配对，形成单价的抗原结合位点【51。Linker一般由5-25个氨基酸构成，目前应用最为广泛的Ifinker是由Huston等【6】设计的15肽序歹U(Gly4Ser)3，具有较好的稳定性和活性。其中Gly是分子量最小、侧链最短的氨基酸，能够增强侧链的柔韧性；而丝氨酸的亲水性最强，可以增强Linker的亲水性【71。不同序列和长度的Linker，构建的scFv具有不同生物学功能。而Linker连接可变区顺序的不同也影响seFv，有研究表明，VL．Linker-VH连接方向的seFv的表达量是VH'-Linker-VL连接方向的20倍，但VH．．Linker．VL连接方向的scFv的亲和力比VL．Linker—VH连接方向高10倍以上I引。3单链抗体的特点和改造类型3．1单链抗体的特点相较于其他类型的抗体，单链抗体的特点在于：(1)分子量小，只有整个抗体的l／6，所以穿透力强，免疫原性低，降低了机体变态反应的发生；(2)与单克隆抗体相似，具有很强的特异性；(3)易于改造；(4)体内半衰期短。3．2单链抗体的改造类型单链抗体本身存在的缺点，包括稳定性差、亲和力低等都能够通过基因工程技术进行抗体改造从而得到改善。常见的改造单链抗体有双链抗体(diabody)【91、seFv,．Fe融合抗体以及二硫键稳定抗体(disulfide．．stabilizedFv,dsFv)[10l。4单链抗体的基因来源单链抗体基因来源主要有两种：一是杂交瘤细胞，二是抗体库。即提取杂交瘤细胞或B淋巴细胞的总RNA，以其为模板反转录合成eDNA，再以此eDNA为模板进行下面的操作。其中应用抗体库技术可以得到单抗技术难以得到的抗体【111。5单链抗体的表达系统多种表达系统可用于单链抗体的表达，但各个表达系统都有着各自的优缺点，在实际应用中应根据需求和现有条件选择合适的表达系统。5．1原核表达系统原核表达系统是表达单链抗体的首选，其中大肠杆菌表达系统是最常用的。原12 第一篇文献综述第二章单链抗体的制备技术及应用发展核表达的重要问题在于如何有效的控制转录起始；而且大肠杆菌不能对抗体进行糖基化修饰，为了成功表达目的抗体，在生成物对细菌有毒的地方防止目的基因缺失和突变是关键。单链抗体在大肠杆菌中以两种形式表达【13】，即可溶性表达和包涵体表达：前者是将细菌的信号序列与单链抗体的氨基端融合，使其分泌到周质内，进行二硫键的形成和肽链折叠，从而形成有活性的抗体；后者合成的蛋白在细胞质中以不溶物的形式存在，只有在体外完成复性等后续工作后，抗体才能恢复活性【l21。原核表达的优势在于培养方法简便快捷、易于掌握、表达量大、成本低，其表达速度和表达产量都优于酵母菌表达系统；缺点在于虽然以包涵体形式表达的蛋白产量较高，可达到菌体蛋白总量的5％．10％，但是经过体外后续加工处理后，最终获得的有活性的蛋白产量往往并不甜14。1刚。5．2真核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统优点更多。真核生物细胞内具有完整的转录、翻译系统，能够促使抗体多肽链正确装配、折叠和糖基化成为有活性的完整分子，提高了抗体的正确构型率；形成的单链抗体的分子结构和自身修饰较真实，具有良好的生物活性；真核细胞易为重组质粒转染，表达产物分泌到培养基中也更便于抗体的分离纯化，更适用于大规模产业化生产。但真核表达系统也存在着局限性：比如存在着抗体表达困难的问题，操作过程也较为复杂、生产周期长、成本高等等，所以目前并没有得以广泛应用【17‘19】。5．2．1酵母表达系统酵母表达系统具备大肠杆菌表达系统的大多数优势，常用的酵母表达系统包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)。其局限性在于过度糖基化致使糖链过长，影响了蛋白的折叠从而影响了抗体的生物学活性，并且还容易导致自身免疫病。5．2．2哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统产生的抗体最接近天然抗体，目前应用较多。哺乳动物细胞具有完整的转录、翻译后加工及分泌机制，因而所表达的抗体具有正确的折叠和空间构象，生物活性良好。Page等用CHO细胞表达重组抗体，表达量达到了DOpg／106cells／day，证明CHO细胞表达基因工程抗体可达成大规模培养的目的，产生的抗体也便于纯化。然而影响哺乳动物表达系统抗体高效表达的因素很多，包括表达载体、抗体结构、宿主细胞类型与修饰等等，目前高效表达载体对抗体产量13 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接F_LISA检测方法的建立的提高已达到哺乳动物表达的极限，即天然水平；以后的研究需着眼于哺乳动物细胞的改造，以期抗体产量的进一步提高。5，2．3昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统应用广泛，具备与大多真核生物相似的翻译、修饰、加工和转运外源蛋白的功能，表达的抗体能够正确组装和糖基化、具有良好的生物学活性【21]】。影响昆虫细胞表达系统表达水平的因素包括载体、启动子、抗体特性、前导肽和培养环境。5．2．4植物细胞表达系统植物细胞表达出的抗体又称之为植物抗体(plantibody)。植物器官种子、叶片以及块茎中都可以进行单链抗体的表达，在叶片中的表达量可至O．01％．0．1％的总可溶蛋白，而且种子和块茎是天然的蛋白储藏器官，蛋白可以长期不被降解；另外种子特异的启动子有助于定点表达重组抗体，简化纯化过程瞄1。而且植物细胞内质网中的分子伴侣可以协助单链抗体完成正确的折叠，并防止其聚集，使得抗体的稳定性和产量得以提高。目前单链抗体应用较多的是转基因植物口引，其优势在于成本低，产量可随需求而改变，内毒素污染低、没有哺乳动物病原体；缺点在于表达耗时长，不确定因素较多，在动物疾病治疗中的植物多聚糖稳定性等问题【24】；此外，因为产物中植物杂质残留多而目的蛋白表达量低，植物表达系统的表达效率较低。目前植物表达系统的表达产物尚未应用于商业化生产12副。6单链抗体在动物疾病研究中的应用随着对单链抗体研究的不断深入，在生物学和医学领域进行的单链抗体相关研究获得了诸多进展，并展现出令人乐观的前景。6．1应用于靶向载体应用抗体分子与抗原特异性结合的特征，将药物或者用于成像的物质与特异性抗体相结合，单链抗体可以用于临床疾病尤其是肿瘤疾病的靶向治疗和影像分析。完整的抗体分子在体内残留时间长，显像时信噪比较低，而且因为分子量大，组织穿透能力差，携带毒性物质时毒性较大。而单链抗体分子量小，穿透能力强，廓清速度快，所以在肿瘤组织中的分布指数高于完整的抗体分子；在放射显像时对身体的危害程度小，排除同位素较快，因此是最佳的显像定位诊断载体【26】。14 第一篇文献综述第二章单链抗体的制备技术及应用发展已有多项实验结果证实了针对不同肿瘤抗原的单链抗体在肿瘤鼠体内的免疫效果，以及在动物模型中良好的显像效果。Naoko等【271将单链抗体与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)相融合，构建了具有肿瘤靶向功能的scFv．CTL，实验结果证实该融合物不仅能够定向杀伤肿瘤细胞，而且在移植到荷瘤小鼠体内后，能够有效抑制肿瘤的生长和扩散，提高肿瘤的治疗效果。Vigor等【28】将单链抗体与用于癌症定位成像的物质相结合，不仅不影响成像物质的大小和速度，而且可以大幅度提高其灵敏度，提高了癌细胞特异性核磁共振的图像清晰度。6．2应用于抑制病毒复制通过基因重组技术将单链抗体与药物或核酸酶融合后，融合物能够与病变细胞特异性结合并进入细胞，阻断某些有害分子的复制和扩增。有研究表明，将抗猪瘟病毒的单链抗体与RNA水解酶结合，单链抗体能够特异性结合被病毒感染的细胞，而RNA水解酶能抑制病毒RNA的复制，从而抑制病毒的活性【291。Zhang等㈣以被禽流感感染的细胞表面的血凝素为抗原制成单链抗体，并和精蛋白融合，实验表明融合抗体能够将抗禽流感病毒的siRNA传递到受感染细胞内，并对其进行基因治疗。还有其他研究证明了特异性重组单链抗体具有抑制IBDV复制【311、抗PEDV感染等能力132】。6．3应用于病原菌检测Torsten等【33】制备的抗沙门氏菌外膜蛋白的单链抗体，能够准确快速的检测猪肉是否感染病原菌。Katherine等【34】制备的抗NAG酶的单链抗体，能够应用于奶牛乳腺炎的早期检测。Shokouh等【35l制备的抗莫能菌素的单链抗体，能够灵敏而快速的检测动物饲料和水中的莫能毒素。Wemmer等【36】制备的识别牛结核杆菌热休克蛋白HSP65的两条单链抗体，改造后得到scFv．CH双价抗体，能够通过识别HSP65检测出牛结核杆菌的感染。6．4应用于体内寄生虫的防治Abi．Ghanem等眵7J制备的抗艾美球虫孢子体单链抗体，经免疫荧光检测证实制备的单链抗体能够与艾美球虫孢子体发生特异性结合。高冬梅【39】制备了抗未成熟虫卵可溶性抗原的单链抗体，ELISA结果显示该单链抗体能够与血吸虫未成熟虫卵、成熟虫卵以及雌虫生殖系统特异性结合；并且经试验证明该单链抗体与正常入肝组织蛋白、正常鼠组织蛋白无交叉反应，可用作靶向治疗性抗体与其它疫苗合用，以提高免疫效果【l2|。 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立7单链抗体技术发展存在的问题因为分子量小、穿透性强等独特的特点，单链抗体在许多领域展现出良好的应用前景，但单链抗体技术仍存在着亟待解决的问题。与天然抗体相比，单链抗体存在着亲和力较弱、生物活性差、稳定性差的问题；而且由于分子量小，半衰期短，不利于在生物体内有效而持久的治疗【39】；并且寻找高效表达单链抗体的系统也是问题之一。16 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第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达第二篇试验研究弟一扁试驵针艽第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达摘要：本试验以实验室制备和保存的小鼠抗鲫鱼IgM单克隆抗体F3a为研究对象，利用Trizol法提取F3a的，巷RNA，反转录合成cDNA后，利用PCR方法扩增重链、轻链可变区基因片段，利用重叠延伸PCR方法将重链、轻链通过Linker连接起来构建F3a-seFv，并将其插入原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒，经测序正确后，阳性克隆转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，SDS．PAGE分析，目的蛋白大小45kDa左右，主要以包涵体形式存在。对表达产物应用Ni-NSTHis．BindResin进行纯化后，进行脲梯度透析复性，并对其进行超滤浓缩，得到目的蛋白浓度为2．6mg／mL。间接ELISA和Westemblotting证实F3a-scFv复性后具有良好的免疫反应性。关键字：单链抗体；单克隆抗体；IgM；序列分析单链抗体(scFv)是通过基因工程学方法将抗体的重链、轻链可变区通过一条弹性肽链连接物(Linker)首尾相接组成的重组蛋白，具有与天然抗体中抗原结合位点相似的结构，保持着天然抗体的特异性和大致接近的亲和力。其具有分子量小、易于基因工程改造、便于大量生产等优点，因此比完整长度的单克隆抗体具有更大的优势和发展前景。IgM是鱼类体液免疫主要的免疫球蛋白，可以作为指示鱼类体液免疫应答的指标，同时也可以用于鉴定和筛选用作疫苗的特异性抗原【11。陈丛林等12]成功构建抗草鱼IgM的单链抗体，并用于分析草鱼呼肠孤病毒的免疫原性。鲫鱼是我国主要的淡水养殖鱼类之一，本试验尝试对实验室制备和保存的小鼠抗鲫鱼IgM单克隆抗体进行单链抗体的构建，为建立鲫鱼疾病的相关检测方法提供物质基础。1实验材料1．1菌种与载体克隆载体pMD19一T购自TaKaRa(大连)公司。大肠杆菌DH50【由本实验室保存。21 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接EUSA检测方法的建立1．2细胞株鼠抗鲫鱼IgM单克隆抗体杂交瘤细胞株F3a，由本实验室臧明发制备和保存。1．3主要试剂Ni-NSTHis·BindResin、Trizol试剂购自invitrogen公司；pfuMix购自博尔迪公司；DL2000、DL5000Marker、小量胶回收试剂盒及DNA连接系统等购自TaKaRa公司；RPMI-1640、二甲基亚砜(DMSO)均为GIBCO产品；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、Anti-HisAntibody、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司：质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。1．4主要仪器设备C02恒温培养箱(ThermoSCIENTIFIC)；超净工作台(Heraeus)；酶标仪(BIO—RAD)；低温台式高速离心机(Heraeus)；微型离心机(Eppendorf)；PCR仪(BIO．RAD)；凝胶自动成像系统(BIO．RAD)；紫外分光光度计(BIO．RAt))。2实验方法2．1杂交瘤细胞株的复苏从液氮中取出冻存的细胞，冻存管立即放入374C水浴中快速搅拌以助融化，酒精棉消毒冻存管，移至超净工作台中，缓慢加入RPMI．1640培养液，1000rpm／min离心5min，弃上清，以完全培养液重悬细胞沉淀，移入细胞培养瓶中，置37。C、5％C02培养箱中培养。2．2杂交瘤细胞的亚克隆在已经稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞中，仍有可能在长期的培养、冻存过程中发生不可预测的变异。本试验采用有限稀释法进行亚克隆，筛选出正确稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。2．2．1饲养细胞的制备(1)将健康Balb／c小鼠拉颈处死，用75％酒精中浸泡10min消毒后，腹部向上置于超净工作台中解剖板上，固定四肢。(2)用眼科剪在小鼠腹部偏下部位剪开一小口，剥开皮肤，露出腹膜。(3)向腹腔内注射10mLRPMI．1640培养液，用酒精棉反复轻揉小鼠腹部 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达lmin，用注射器回抽腹腔液体，注入离心管中，1000rprrdmin离心10min。(4)收集上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液，调整细胞浓度到1．5×103／mL2．2．2有限稀释法筛选(1)96孔细胞培养板分装O．1mL饲养细胞(提前24h准备，置C02培养箱中备用)。(2)自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞(亦可自24孔培养板孔中收集)，制成悬液，浓度调整为1-5x103／mL。(3)调整细胞浓度为20个细胞／mL，于96孔板A、B、C三横排0．1mL／孑L，即2个细胞／孔。调整细胞浓度为10个／mL，D、E、F三横排O．1mL／孔，即1个／孔。调整细胞浓度5个／mL，G、H两横排O．1mL／孔，即0．5个／孔。(4)培养4．5d后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200“L／孔。(5)第8．9d时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。(6)经过3次亚克隆，阳性孔杂交瘤细胞转移至24孔板扩大培养，待细胞足够多后，转移至细胞培养瓶中进一步扩大培养，冻存杂交瘤细胞。2．3杂交瘤细胞总RNA的提取(1)在细胞培养瓶中培养杂交瘤细胞，将培养液弃去，用灭菌lxPBS洗一次。(2)每10cm2的细胞中加入lmL的Trizol，水平放置一会儿，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后吹打细胞使其脱落。(3)将上一步的裂解液移至离心管中，反复吹吸，观察裂解液中没有明显沉淀为止，室温静置5min。(4)加入氯仿(Trizol体积的1／5量)，剧烈震荡15s，待溶液完全乳化后，室温静置5min。(5)12，00094。C离心15min，吸取无色上清层转移至新的离心管。(6)加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15．30℃下静置10min。(7)12，00094。C离心10min。(8)小心弃去上清，缓缓沿管壁加入75％乙醇lmL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12，00094。C离心5min后小心弃去乙醇。(9)室温干燥沉淀2-Stain，加入适量的RNase．free水溶解沉淀，测得OD280和 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接EIJSA检测方法的建立OD260值，计算OD260／OD280比值，估算样品中RNA的含量及纯度。样品置于-80。C保存。2．4反转录合成cDNA使用TaKaRa公司产品反转录试剂盒进行操作。(1)基因组DNA除去反应将下列组分加入DEPC处理过的EP管中，42℃水浴2min，4"C放置。5xgNDAEraserBuffergDNAEraserTotalRNARnaseFreedH2029Ll此0．5／agUpto109L(2)反转录反应按照下表在冰上进行反应液配置，混匀37。C孵育15min后，854C反应5sec，最后于一20℃保存。5xPnmeScfipt5Buffer2PrimeScriptRT。EnzymeMix1RTPrimerMix(1)的反应液RNaseFreedH2049LlgL1此10此Upto20pL2．5可变区基因的克隆及鉴定2．5．1引物设计参考小鼠源性单克隆抗体可变区基因通用简并引物重、轻链可变区上下游引物，分别设计扩增引物，命名见表3．1，引物由Invitrogen公司合成。表3-1扩增轻链、重链可变区基因的引物Table．3-lPrimerofgenesusingforVLandVHamplification引物名称引物序列(5’—3’)VLl一FVLl一BVHl-FVHl-BGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCACCGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGGTGAGGAGACKGTGACHGTGGTSCC}简并碱基S：C／GM：A／CR：A／GW：A／TK：G／TH：A／C／T 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达}引物命名”B”即”Backward”，代表’'towardthe3’endoftheantibodygene”；"F”即”forward”，代表'towardthe5’endof廿leantibodygerm'’2．5．2单克隆抗体可变区基因的扩增以反转录合成的cDNA为模板，用表3．1引物扩增VL、VH基因，进行梯度PCR，确定最适退火温度。PCR扩增体系：PCR扩增条件：CDNA上游引物下游引物2xHSTMMixddH20O．51．tLl皿1uL10儿7．5p．L94℃预变性3min94℃变性30see、45"C一65"C退火30see}．30cycles72℃延伸30min一72℃终延伸10min4"C保存2．5．3PCR产物凝胶电泳回收与纯化将PCR体系扩大到2001aL进行大量扩增，使用宝生物工程(大连)有限公司小量胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。(1)使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。(2)紫外灯下将含有目的DNA的琼脂糖凝胶切下，称重，切碎胶块，放入1．5mLEP管中。(3)加入3倍凝胶体积的BufferGM，混匀后室温15．25。C融化胶块，间断震荡(约5．10min)。(4)将SpinColumn安置于CollectionTube上，将步骤(3)液体转移至SpinColumn中，12000rpm离心lmin，将滤液转移至SpinColumn中再离心一次，提高回收率。 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立(5)弃滤液，将7009L的BufferWB加入SpinColumn中，室温12000rpm离心30see，弃滤液。(6)重复步骤(5)。(7)将SpinColumn安置于CollectionTube中，室温12000rpm离心lmin。(8)将SpinColumn安置于新的1．5mLEP管中，于SpinColumn膜的中央加入201xL灭菌蒸馏水，室温静置lmin。(9)室温12000rpm离心1rain洗脱DNA，洗脱下的DNA于．20℃保存。2．5．4PCR产物连接转入T．vector连接反应体系：纯化的PCR产物pMD19TSimpleVectorSlutionI4．51xL0．5¨L5pL轻轻混匀，16。C连接过夜，构建19T／VH和19T／VL质粒。2．5．5DH5a感受态细胞的制备(1)从37℃培养16．24h的新鲜平板上挑取单菌落，转接到LB培养基中，37℃l80rpm3h培养至OD600在0．4．0．6之间，冰上放置10min。(2)取lmL菌液，5000rpm4。C离心10min，弃上清。(3)加入200I．tL预冷的0．IMCaCl2重悬，冰上放置30min。(4)5000rpm4"C离心10min，弃去上清。(5)加入80I-tL预冷的0．1MCaCl2重悬，4℃放置12．24h备用。2．5．6重组质粒转化大肠杆菌DH5a(1)将5此连接T载体产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。(2)将装有混合物的EP管置于42。C水浴中85—90see，迅速放回冰上，冷却2min。(3)于上述混合液中加入lmLLB培养基，混匀后于37。C100rpm震荡培养lh。(4)5000rpm离心5min，弃去部分上清，留2001xL重悬沉淀。(5)将上述混合液涂布于含有Amp抗生素的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收。26 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达(6)倒置平板，于37℃培养16．18h后可出现菌落。2．5．7菌液PCR鉴定(1)准备1．5mLEP管并编号，每支加入ImLLB-Amp+培养基，挑取阳性质粒菌落，37℃180rpm震荡培养6h。(2)以上述菌液为模板，以表3．1引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：94。C预变性3min，94。C变性30see，55。C(VL)或59。C(VH)退火30see，72*(2延伸lmin，循环30次，72℃延伸10min。(3)取10pLPCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的基因，并根据检测结果选择保留阳性克隆菌液，并将菌液送测序。2．5．8质粒的小量制备挑选阳性质粒菌液接入LB．Amp+培养基中，37"C震荡培养12．16h。使用OMEGA的E．Z．N．A．ⅣPlasmidMiniKitI进行质粒的提取。(1)取5mL菌液10，0009离心lmin收集菌体沉淀，弃去上清，加入250pLSolutionI[gNaseA重悬沉淀，剧烈震荡使菌体完全重悬。(2)加入250pLSolutionlI，温和颠倒混匀，室温静置2min。(3)加入350“LSolutionlII并立即颠倒混匀，管中形成白色絮状沉淀物。。(4)室温13，0009离心10min，将MiniprepColumn安置于CollectionColumn上，将上清转入MiniprepColumn中，室温10，0009离心lmin。(5)弃去CollectionColumn中的液体，在MinipmpColumn中加入500pLBufferHB，室温10，0009离心lmin，弃去液体。(6)在MiniprepColumn中加入700“LDNAWashBuffer，室温10，0009离心lmin。(7)重复步骤(6)。(8)13，0009离心2min。(9)将MiniprepColumn置于新的1．5mLEP管中，加入30此ElutionBuffer，室温静置2min，室温13，0009离心1min收集滤出液。(10)测定OD2价OD2舳估算质粒浓度及纯度。2．6单链抗体基因(F3a-scFv)的构建2．6．1拼接F3a-scFv基因的引物设计与合成27 鲫鱼ION单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体问接EI．ISA检测方法的建立根据原核表达载体pET32a(+)图谱，选择EcoRI与HindlII的酶切位点作为F3a．scFv全长基因5’端和3’端的酶切位点，以VH-(GlyaSer)4．VL作为F3a．scFv的走向，结合前面克隆并测序正确的重链、轻链可变区序列，设计并合成用于vH、vL基因拼接的引物，在重链可变区下游及轻链可变区上游引入Linker片段。所有引物由Invitrogen公司合成。引物序列如下：P1：5'-CCG鱼△△Ⅱ￡GAGGTCAAACTGCAGGAGTCA．3’P2．5"-ggagccgcc(agaaccaceaccacc)2TGAGGAGACTGTGACCGTGGT-3’P3：5'-ggcggctccggtggatceGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA．3’P4：5'-CCC丛鱼￡丑[CCGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC．3’其中P1为VH上游引物，下划线部分为引入的EcoRI酶切位点，P2为VH下游引物；P3为VL上游引物，P4为VL下游引物，下划线部分为引入的HindlII酶切位点。P2和P3小写部分为连接肽基因序列。2．6．2重链可变区DNA的准备Pfu高保真酶从测序正确的19T／VH质粒中扩增平末端VH．Linker序列，梯度PCR确定最适退火温度，反应体系如下：PCR扩增条件：19州H质粒P1PrimerP2Primer2xUltra—PfuMasterMixddHEO0．19LlgL259LUpto509L94℃预变性3min94℃变性30sec、45℃一65℃退火30see}30cycles72。C延伸45sec。72℃终延伸10min4℃保存PCR产物凝胶电泳胶回收与纯化，方法同2．53。 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达2．6．3轻链可变区DNA的准备Pfu高保真酶从测序正确的19T／VL质粒中扩增平末端Linker-VL序列，梯度PCR确定最适退火温度，反应体系如下：PCR扩增条件：19TNL质粒O．1lxLP3Prirner1此P4Primer1此2xUltra-PfuMasterMix259LddH20Upto50旺94℃预变性3min94℃变性30see、45'C·65。C退火30sec}-30cycles72℃延伸40sec一72℃终延伸10min4"C保存PCR产物凝胶电泳胶回收与纯化，方法同2．5．3。2．6．4重叠延伸PCR拼接F3a-scFv全长基因以P1／P2PCR产物VH．Linker、P3／P4PCR产物Linker-VL为模板，重叠延伸PCR方法拼接F3a．scFv全长基因，PCR反应体系如下：PCR扩增条件：VH-LinkerLinker-VLPIPrimerP4Primer2xUltra-PfuMasterMiXddH20lgL2“L21xL259LUpto509L94℃预变性94℃变性57℃退火72℃延伸蒹0sec-30cycles 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接EUSA检测方法的建立72℃终延伸2min反应完毕后，补加rTaqDNA聚合酶72。C延伸lOmin。PCR产物凝胶电泳胶回收与纯化，方法同2．5．3。2．6．5构建19T／F3a-scFv重组质粒并转化大肠杆菌DH5a方法同2．5．6。2．6．6菌液PCR鉴定并送测序方法同2．5．7，菌液PCR使用引物Pl、P4。2．6．7质粒的小量制备方法同2．5．8。2．7pET32a-F3a-scFv重组表达载体的构建2．7．1原核表达载体pET32a(+)与重组克隆抗体F3a·scFv的限制性内切酶消化及胶回收用EcoRI和HindlII对19T／F3a-scFv和pET32a(+)空载体进行双酶切，反应体系(50pL)-EcoRI胁2棚I10xMBuffer质粒ddH202此21xL5此3峙Upto50rtL反应条件：混匀后，37"C水浴4h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，方法2．5．3。2．7．2连接反应连接反应目的片段与载体片段摩尔比为7：1，反应体系(109L)：F3a-scFv回收片段pET32a(+)回收片段10xT4Bu【ffer6laL2止lp．L 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达T4DNAligaselpL反应条件：混匀后，16。C连接过夜，构建pET32a-F3a-scFv重组原核表达载体。2．7．3重组质粒转化大肠杆菌DH5a方法同2．5．6。2．7．4阳性克隆质粒的提取及酶切鉴定方法同2．5．8。pET32a—F3a．scFv质粒提取后，使用EcoRI和Hin棚I进行双酶切鉴定。2．8pET32a．F3a-scFv融合蛋白的原核表达2．8．1感受态细胞BL21(DE3)的制备及重组质粒pET32a-F3a-scFv的转化感受态细胞BL21(DE3)的制备方法同2．5．5，抗生素抗性筛选平板为Amp100I-tg／mL的LB平板，挑取阳性克隆后提取质粒并送测序。2．8．2pET32a-F3a-scFv融合蛋白的诱导表达2．8．2。1蛋白的小量诱导表达新鲜的BL21／pET32a-F3a-scFv菌液1：100转接至LB培养基，37。C180rpm摇床震荡培养2．3h至对数生长期，OD600大约为O．4．0．6。加入IPTG至终浓度1．0mmol／L诱导4h，培养物离心后以其1／20体积的PBS重悬，取样品SDS．PAGE检测细胞总蛋白中目的蛋白的表达情况。2．8．2．2蛋白的大量诱导和目的蛋白的胞内定位(1)蛋白大量诱导表达方法同小量诱导表达，加IPTG前吸取lmL未诱导的菌液作为对照。(2)诱导结束的菌液4"C9200rpm离心5min，弃上清。(3)用PBS重悬沉淀，4"C9200rpm离心5min，弃上清。(4)用1／20原菌液体积的上清BmdmgBuffer重悬沉淀，可保存于-20。C。(5)重悬菌液进行超声破碎，工作5see，问隔10see，破碎99次×2。(6)4"C9200rpm离心lOmin，分别收集上清和沉淀，取样进行SDS—PAGE检测目的蛋白的表达情况。2．8．2．3包涵体的纯化3l 鲫鱼IOM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立(1)超声破碎后的沉淀使用包涵体BindingBuffer溶解重悬，30"C水浴1h或37。C180rpm震荡30min帮助溶解。溶解后以4。C1000rpm离心10min，取上清以0．4511m滤膜过滤。(2)Ni-NSTHis．BindResin纯化蛋白，步骤如下：I洗柱：将lmL的镍柱用5mL20％7,醇过柱后，用5mLddH20以lmL／min流速过柱，继而用5mL包涵体BindingBuffer过柱。II将0．459m滤膜滤出的蛋白以lmL／min(尽量慢)的流速进行过柱，收集蛋白滤出液。IⅡ用10mL包涵体BindingBuffer以1mL／min(尽量慢)的流速进行过柱，收集流出液。Ⅳ用10mL包涵体ElutionBuffer以lmL／min(尽量慢)的流速进行过柱，收集流出液分装于EP管中。V洗柱：以10mL包涵体BindingBuffer以lmL／min的流速进行过柱后，用5mLddH20以lmL／min流速过柱，最后以5mL20％乙醇以lmL／min流速过柱，盖好镍柱，4℃保存镍柱。将步骤III、Ⅳ、V收集的流出液进行SDS．PAGE分析。2．8．2．4重组蛋白的透析复性(1)剪取适当长度(15—20cm)的透析袋，在沸腾的透析袋煮液中水煮30min，用去离子水清洗透析袋。(2)调整蛋白浓度低于lmg／mL，将蛋白液装入处理好的透析袋中，两端扎紧，依次在4M尿素、2M尿素、1M尿素、0．75M尿素、0M尿素中进行透析，全程在4。C进行，使用磁力搅拌器每个步骤透析4h。(3)收集复性后的蛋白，12000rpm离心15min，收集上清。2．8．2．5蛋白的浓缩将复性完成的目的蛋白装到超滤浓缩管(截流量>10kDa，Millipore公司)中，4。C35009／min离心，每隔5—10min观察一次。浓缩后的样品分装到1．5mLEP管中，于．20℃保存。2．8．2．6蛋白浓度测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定。(1)配置BCA工作液：根据标准品和样品数量，按试剂A试剂：B体积比50：132 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgH单链抗体融合基因的构建和表达进行配置，充分混匀。(2)将蛋白标准品按0，1，2，4，6，8，10此加到96孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌ddH20补足到lOlL；取10皿待测样品(<500嵋，mL)加入到96孔板中，每个测定做2个平行。(3)向待测样品孔和蛋白标准品孔中加入200．LBCA工作液，混匀。(4)37℃温育30rain，冷却至室温。(5)酶标仪562nm波长下测定吸光度。(6)制作标准曲线，从标准曲线中求出样品浓度。2．9F3a-scFv生物学活性分析2．9．1WesternBlotting检测F3a．scFv复性蛋白(1)取纯化的鲫鱼IgM蛋白进行SDS．PAGE。(2)转膜：将滤纸和NC膜根据电泳胶大小剪齐后放入膜转印缓冲液泡5min，然后由下往上依次按滤纸、NC膜、胶、滤纸的顺序铺好，清除气泡并避免上下层滤纸之问的接触。接通电转槽电源，采用电流=长×宽x0．8mA的恒流进行转印，2h。(3)封闭：用5％脱脂奶4℃封闭过夜。(4)免疫反应：以复性完成的F3a-ScFv作为一抗，37℃作用1．5h；用l：5000稀释的抗His标签鼠源单抗，37"C作用1．5h；以1：5000稀释的山羊抗鼠IgG酶标抗体作为二抗，37℃作用lh；每个反应间用TBST洗三次，5min／次。(5)显色反应：用DAB底物显色液进行显色。2．9．2间接ELISA法鉴定F3a-scFv的活性用20I，tg／mL的鲫鱼IgM包被酶标条4℃过夜，用5％脱脂奶37。C封闭2h，1：20、1：40、1：80、1：160、l：320、1：640、1：1280、1：2560、l：5120、l：10240倍比稀释加入纯化复性后的F3a-scFv，以pET32a空载蛋白为阴性对照，37℃孵育1．5h。之后加入抗His标签的鼠源单抗，37"C孵育1．5h。以山羊抗鼠IgG酶标抗体作为二抗，再次孵育1h。每次孵育间隔均用PBST洗三次，每次5min。最后，加入TMB显色液，2MH2S04终止显色，于酶标仪OD450读值。2．10F3a-scFv酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法进行抗体的标记，方法如下：(1)将5mg的HRP用0．5mL蒸馏水充分溶解，加入新配置的O．06M的Nal0433 鲫鱼IgN单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立0．5mL混匀，4℃静置30min。(2)加入O．16M乙二醇溶液0．5mL，室温静置30min。(3)按HRP：目的蛋白摩尔比3：1加入纯化的蛋白，混匀，于0．05MpH9．5CBS中透析过夜。(4)加入NaBI-h(5mg／mL)0．2mL，混匀，4。C静置2h。(5)缓慢加入等体积饱和硫酸铵，4。C静置30rain。3000rpm离心30min，弃上清，沉淀以少许0．02MpH7．4PBS溶解，4"C透析除盐。(6)次日以10000rpm离心30min，出去不溶物即HRP标记的pET32a-F3a-scFv。(7)以纯化的鲫鱼IgM包被酶标条，HRP标记的F3a-scFv为一抗，反应结束后加TMD底物显色液显色，测定效价。(8)效价测定结合能力后，加入等量甘油，．20℃保存。3结果3．1杂交瘤细胞的亚克隆经三次亚克隆后，细胞克隆孔抗体阳性率均为100％，细胞培养上清液测定效价为1：5120。3．2杂交瘤细胞总RNA的提取与反转录合成cDNA从稳定分泌鲫鱼IgM的杂交瘤细胞株F3a中提取总RNA，用分光光度计测得总RNA的A260／280=2．03，浓度为3078．199／mL；反转录合成的cDNAA26以80-1．87，浓度为3475．01xg／mL。3．3可变区基因VL、VH的扩增以反转录合成的eDNA为模板，通过设计好的抗体可变区引物(见表3．1)，进行梯度PCR扩增，获得324bp的VL基因片段(图3．1)和354bp的VH基因片段(图3．2)，确定VL基因PCR扩增的退火温度为55"C，VH基因PCR扩增的退火温度为59℃。3．4重组质粒pMD19T／X的筛选(X为克隆的目的片段)VL、VH基因片段分别与T载体连接转入DH5a后，挑取单菌落进行PCR鉴定，结果见图3．3。由图3-3可见，pMD19T／VL、pMD19T／VH均有阳性克隆，目的条带 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达与理论值一致。将3号和15号克隆送Invitrogen上海公司测序。2，500bp1，000bp250bpM1234565，000bp1，000bp500bp250bp图3．1轻链可变区的扩增Fig．3-1AmplificationofVLgeneM：DNAMarker(DL15，000)：1-6：48"(2，50．8℃，55．2"C，58．1℃，62．4℃，65．0℃5,000bp1,000bp500bp250bpM123456图3-2重链可变区的扩增Fig．3-2AmplificationofvHgeneM：DNAMarker(DL5,000)：1-6：59"(2．57℃，54．3℃，50．9"12，48．1℃，45"CM1234567891011M12131415161718192021图3—3重组克隆pMD19T／VLjEglpMD19T／VH菌液PCR鉴定Fig．3-3IdentificationofrecombinantclonepMD19幔～LandpMD19幔NHbyPCRM：DNAMarker(DL5,000)：1-11：IdentificationofpMD19T，vL；12-21：IdentificationofpMD19盹3．5可变区基因的测序结果送检菌液测序结果使用DNAMAN软件分析，并将序列递交http：／／www．imgt．org与IMGT数据库进行比对，结果显示序列特征符合小鼠抗体可变区序列特征，判断所得到的阳性克隆确为F3a单克隆抗体可变区基因。轻链可变区序列为324bp，VL-ORF序列如下：5’．GACATrCAGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAGACTGTCACCATCTCATGTCGAGCAAGTGACAATA．r丌ACACTrATTTAGAATGGTATCAGCAGAAGCAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTT35 鲫鱼lgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立AGCAGAGGGTGTGCCATCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAG下Iv丌CTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGAr兀TGGGAGTTA兀ACTGTCAACATCATrATGGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACG．3’重链可变区序列为354bp，VH．ORF序列如下：5’．GAGGTCAAACTGCAGGAGTCAGGGACTGTGCTGGCAA(X}CCTGGGGClvr℃CGTGAAGATGTCCTGCAAGGCl_I℃TGGCTACAGCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGGTAllTATCCTGGAAATAlTGATACTATCTACAACCAGAAGTTCAAG(ⅪCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATGGACCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTAmCTGTACAAGGGAAGGTAACTACGCGGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACAGTCTCCTCA．3’3．6单链抗体基Nt(F3a．scFv)的构建3．6．1VH-Linker和Liner-VL的扩增通过梯度PCR，以191ⅣH质粒为模板，用P1、P2引物扩增得到VH．Linker基因(图3-4)，片段大小为408bp；以19T／VL质粒为模板，用P3、P4引物扩增得到Linker-VL基因(图3—5)，片段大小为363bp。目的片段扩增结果与预期结果相符。1234567MI234567图3-4VH-Linker的扩增Fig．3-4AmplificationofVH—LinkergeneM：DNAMarker(DL15，000)；1-7：46．7℃，50．5℃，53．4"C，56．7℃，59．6"C，61．8"C，64．6℃，50000050b图3．5Linker-VL的扩增Fig．3-5AmplificationofLinker-VLgeneM：DNAMarker(DL15，000)；1-7：46．7℃，50．5℃，53．4℃，56．7℃，59．6℃，61．8℃，64．6℃ 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达3．6．2F3a-scFv全长基因的拼接重叠延伸PCR拼接VH．Linker与Linker-VL基因片段，获得两端带有不同酶切位点的F3a-scFv全长序列，全长片段大小为750bp(图3．6)，与预期结果符合。F3a-scFv胶回收后克隆入pMD19T载体，连接产物转化DH5a，随机挑选菌落PCR鉴定后，进行EcoRI和HindIII双酶切鉴定，得到2．7kb和750bp两条条带(图3．7)，表明外源基因插入克隆成功。5，000bp——1,500bp——750bp——500bp——250bp——图3-6F3a-scFv基因片段融合PCR的扩增Fig．3-6AmplificationofF3a-scFvgenebySOE．PCRM：DNAMarker(DL5,000)；l：F3a-scFvgene5．QQQ3；0002．0001．500750500图3．7重组质粒19T／F3a-scFv的酶切鉴定Fig．3-7Identificationof19T／F3a-scFvrecombinantplasmidbyrestrictionenzymeM：DNAMarker(DL5,000)；1：digestedbyEcoRIand月枷3．6．3测序结果分析选取PCR和双酶切鉴定正确的菌落质粒送测序，DNA序列测定结果(图3．8)证实F3a-seFv的VH和VL部分与原扩增的VH、VL序列一致，酶切位点正确，Linker序列正确，F3aoscFv拼接成功。F3a-scFv连接顺序为VH．Linker-VL，基因全长750bp，编码250个氨基酸，其中含有360bp的VH基因片段和330bp的VL基因片段。与IMGT数据库比对，扩增片段符合小鼠抗体可变区特征；VH、VL基因序列中均有4个FR区和3个CDR区。开始6个碱基和末尾6个碱基分别为EcoRI和肺删Ⅲ酶切位点；小写字母部分为Linker序列，其编码的氨基酸序列为(Gly4Ser)4。37 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接EITSA检测方法的建立GAATTCGAGGTcA姓C曩GCAGGAGTCAGGGACTG碓CTGGCAAGGCCTGGGGCrTcCGTGEF基芏K量坌至§鱼I!量叁基￡鱼矗§∑玎tlAAG娜TccTGCAAGGcTIcTGGc氆CAGc丌rAcCAGc强CTGG舶cAC粥GAAAAK堂SeKASGYSFTSYWMt-IWVKCD砒CAGAC》GCCTGGACAGGGT仉茂GAA瑚ATT(篷玎GGT式rr硝TCCTGGAAA：rAITGA丁ACTQ基￡昼Q垡圣至受l鱼l芏E堡过l垦I玎趋CDR2筒陀弘CAACCAGAAGnCAAGGGCAAG(托CA气ACTGACTGCAGICACATCCGCCAGCAC丁l芏釜坌KEK鱼K△KL至叁!至S△S至GCC工^CATGGACCTCAGCAGC(XGACAAATGAGGACTCTGCGGTC工^T强CTGTACAAGG△芏丛旦圣S堇=王薹至旦S叁芏兰￡王基玎UGA文GGTAAC工跹(；∞GAC蜀盯GAC强C15GGGCC姓GGCACeACGGWACAGICT℃e雷巴生量垒薹工△坌巨坌X翌堡Q鱼I∑至!S§CDR3HNggtggtggf终强ggtggtggtggttCtggcggeggcggctee掣鳕ggt印teeGACATTCAGCTGACCCAGTCT堡垒垡垒曼堡垒垡垡曼昼鱼壁垒S鱼壁垡鱼曼坌lQ圣至Q墨L如Lkel"CCAGCCTCC嗽TcT(托ATcTGTGGGAGAGACTGTCACCATcTCAl’GTGGAGCAAGTGAC呈△S曼△S!垒至王∑!i§坌基△S旦玎tlAATA工_r强CACT强=r吼气GAATGGE虹CAGCAGAAGCAG泓AAAH：TCCTCAGCl℃C卫G薹l芏王芏圣戛显兰QQKQ鱼K§￡Q圣LCDRl戤GTc烈rAAT(瓮AAA^ACC仉文(挖AGAGGGTG丁．GCCATcCAGGrrCAGTGoCAGTGGATCA!兰基△KI垦盘星鱼∑￡S基至曼垒S垒SCDR2GGCAcAcAG丌rTcTCrGAAGATcAACAGCC粥CAGccTGAAG盯孤GGGAGTW强C垒!QE§圣基l基§量坌里至坌夏堡§芏芏flUTOTC从C盯CATt盯GGTAcTCCG工托ACGrrcGGAGGGGGGAcCAAGCTGGAGATcAAA￡Q壁嚣芏鱼至里兰至亘委鱼IK垦至!KCDR3m4CGGAAGCl-r星X己图3-8F3a-scFv基因测序结果分析Fig．3-8SequencinganalysisofF3a-scFvgene3．7pET32a．F3a．scFv重组表达载体的构建F3a-scFv基因片段纯化回收后，经EcoRI和HindlII双酶切后插入原核表达载体pET32a，构成重组表达载体pET32a—F3a-scFv。连接产物转化DH5ct，经菌液PCR鉴定后(图3—9)，阳性克隆提取质粒进行双酶切鉴定，分别出现了750bp的F3a-scFv的条带和5900bp左右的pET32a的条带(图3—10)。 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达5，000bp1．000bn750bp500bp图3-9重组克隆pET32a-F3a-scFv的菌液PCR鉴定Fig．3-9IdentificationofrEcombinantclonepET32a-F3a-scFvbyPCRM：DNAMarker(DL5,000)；I-10：pET32a-F3a-scFv；11：Negativecontrol12：PositivecontrolMl5，000i：黜l，000750500图3—10重组质粒pET32a-F3a-scFv的酶切鉴定Fig．3-10IdentificationofpET32a-F3a-scFvrecombinantplasmidbyrestrictionenzymeM：DNAMarker(DL5,000)；1：digestedbyEcoRIandHind皿3．8pET32a-F3a．scFv融合蛋白的诱导表达重组质粒pET32a-F3a-scFv转化BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导后，经SDS．PAGE结果显示(图3．11)，未诱导的对照菌未见明显的表达蛋白，而诱导菌在45kDa处出现一条明显蛋白条带，与预测融合蛋白的大小相符。目的蛋白主要以包涵体的形式存在，提取包涵体后，经过镍柱纯化，脲梯度透析复性后，最终获得纯化的F3a-scFv蛋白。目的蛋白经过10kDa超滤管浓缩，并做缓冲液的置换，置换缓冲液为pH7．4PBS。用BCA法检测蛋白，做BSA标准曲线(图3．12)，测得目的蛋白浓度为 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立234M56攀姻渺一45kDao_—_M叫——_____，哆图3．11F3a-scFv蛋白的SDS．PAGE分析Fig．3-1lSDS·PAGEanlysisofF3a-scFvproteinM：ProteinMarker：；l：uninducedwholebacterialprotein；2：inducedwholebacterialprotein；3：suspematant；4：precipitation；5、6：pruifiedF3a-seFvv=0．0296x+0．1318／R2=0．9921／／7／’，r00．5l蛋白浓度(m影afl)图3．12BSA标准曲线Fig．3-12standardcurveofBSA3．9F3a-scFv抗原结合活性3．9．1F3a-scFv与鲫鱼IgM的WesternBlotting分析1．5鲫鱼IgM进行SDS-PAGE(图3—13)，蛋白IgM的重链、轻链大小分别为79．2kDa和25．5kDa。Westernblotting结果(图3．14)表明，F3a-scFv能够与鲫鱼IgM发生特异性结合反应，在79．2kDa处有清晰条带。5P)453525l5Oc：¨乱吣叱啦n叭c=叫亘lnl(1 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达Ml‘秦鍪蒿编豢㈥116l(Da——_，P66．2kDa——㈣25kDa———∥醪黑愚豳图3-13鲫鱼IgM的SDS-PAGEFig．3-13SDS-PAGEanalysisofIgMM：ProteinMarker：1：purifiedlgM3．9．2间接ELISA测定F3a-scFv的活性130l①a——95kDa——72ld)a——43kDa——34kDa——图3-14scFv与鲫鱼IgM的WesternblottingFig．3-14WesternblottinganalysisofscFvagainstIgMofCrussiancarpM：ProteinMarker；1：scFvagainstIgM以纯化的鲫鱼IgM包被酶标板，F3a-scFv作为一抗倍比稀释加入，同时以pET32a空载蛋白为阴性对照，结果表明，F3a-scFv在稀释度1：5120(0．511tg／mL)时仍然可与鲫鱼IgM发生特异性反应。见表3—2。表3-2间接ELISA检测F3a-scFv活性Table．3-2BindingactivitytopurifiedF3a-scFvbyindirectELISA3．10F3a—scFv酶标抗体的制备采用改良过碘酸钠法进行HRP标记，制备好的HRP／scFv克分子比值为0．9722，符合制备要求。酶标条包被纯化的鲫鱼IgM，HRP标记的F3a-scFv为一抗做直接ELISA，效价测定为1：640。4讨论41 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接EHSA检测方法的建立20世纪70年代出现的杂交瘤单克隆抗体(Ⅱu也)技术问世至今仍应用广泛，但是单克隆抗体存在的诸多缺陷尚未能克服。它的分子量大，不容易穿过血管屏障到达靶组织；其本身的异源性使得它不能直接用于疾病的治疗等等。而与之相比，单链抗体的分子量小、穿透性强，体内半衰期短，特异性强，便于经济有效的生产，并且易于基因工程学的改造，是目前报道最多的基因工程学抗体。本试验是基于鲫鱼IgM单克隆抗体的基础上，进行单链抗体的构建，并成功在大肠杆菌表达系统中进行表达。经过纯化、复性、浓缩等工作后，得到有活性的鲫鱼IgM单链抗体。4．1scFv基因的构建scFv是指将抗体的VH和VL通过一条弹性肽链连接物(Linker)首尾相接组成的单一肽链，VH和VL折叠形成相对独立的结构域，由亲水性的弹性Linker相连，形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构，且仍保持着天然抗体的特异性和大致接近的亲和力。scFv的基因来源主要是杂交瘤细胞和抗体库，本试验在获得抗鲫鱼IgM单克隆抗体的基础上，提取杂交瘤细胞的总RNA，反转录合成cDNA后，设计特异性引物PCR扩增出VL、VH基因片段，利用重叠延伸PCR方法通过Linker将可变区基因片段连接起来，构建VH．Linker．VI，顺序的scFv。scFv构建时，可变区的顺序可以是VH．Linker-VL，也可以是VL—Linker．VH，两种顺序的scFv均有报道口‘5】。研究证实，VL．LinkerWH顺序的scFv更容易形成多聚体，很大程度上，这是由于VH、VL不对称性造成的。因为VL．VH顺序scFvVL羧基端与VH氨基端的距离要大于VH—VL顺序时VH羧基端与VL氨基端的距离，所以如果使用相同的Linker连接可变区片段，那么VL．Linker．VH顺序的scFv要比VH．Linker．VL顺序的scFv受到更多限制，从而形成高分子量聚合体的趋势更强。也有研究表明，VL—Linker—Via连接的表达量可能为VH—Linker-VL顺序的20倍，但VH-Linker-VL的亲和力却比VL．Linker-VH高10倍以上【6】。本试验采取VH．Linker-VL构建scFv。scFv的Liner要求可变区连接后能够自由折叠，形成正确的空间构象。目前使用最广泛的是包含Gly和Ser残基的连接肽，其中Gly是侧链最短、分子量最小的氨基酸，能够增加侧链的柔韧性；而Ser的亲水性最强，可以增加Linker的亲水性【7J。本试验采用(Gly4Ser)4连接肽，通过PCR方法在VH基因片段的c端和VL基因片段的N端引入Linker，采用重叠延伸PCR方法将VH—Linker和Linker-VL片段进行拼接，构建VH．Linker．VL走向的scFv基因。4．2scFv的表达 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达scFv能够在多种表达系统中进行表达，其中大肠杆菌表达系统虽然不能对重组蛋白进行糖基化修饰，但是因为其培养简单、生长迅速、成本低廉，并且能够在短时间内产生大量目的蛋白，便于分析、纯化和应用，所以是比较常用的蛋白表达系统。scFv在大肠杆菌表达系统中可以以可溶形式和包涵体形式两种形式表达，前者是将细菌的信号序列与单链抗体的氨基端融合，使其分泌到周质内，并完成二硫键的形成及肽链折叠，从而形成具有生物活性的抗体片段；后者合成的蛋白以不溶物的形式存在于细胞质中，还需要在体外进行复性等后续程序，才能得到活性抗体【3】。本试验中采用pET32“+)原核表达载体，它是用于克隆和高水平表达目的片段融合蛋白的载体，包含便于检测和纯化的His·Tag和S·tag序列，能够在IPTG诱导下利用宿主菌的T7RNA聚合酶，高效表达T7启动子下游的外源基因。本试验将scFv基因片段插入表达载体pET32a，限制性内切酶EcoRI和Hin扭I双酶切鉴定，证实重组质粒pET32a-scFv构建成功。重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3)，菌液PCR鉴定阳性克隆送测序，测序结果与IMGT数据库比对，扩增片段符合小鼠抗体可变区特征。阳性克隆经IPTG诱导表达，SDS．PAGE结果提示目的蛋白大小约在45kDa，符合理论值，并且该融合蛋白在包涵体中大量表达。虽然以包涵体形式存在的蛋白还需要后期的纯化和复性工作，但包涵体形式蛋白表达量高，更有利于蛋白的大量制备。4．3scFv基因序列分析scFv基因序列递交http：／／www．imgt．org与IMGT数据库进行比对，VH和VL与鼠源可变区片段同源性分别为94．10％和96．06％，VH、VL基因序列中均有4个FR区和3个CDR区。VH基因CDR区氨基酸序列分别为CDRl：DNIⅥY；CDR2：NAK；CDR3：QHHYGTPYT。VL基因CDR区氨基酸序列分别为CDRl：GYSFTSYW；CDR2．-IYPGNIDT：CDR3：TREGNYADFDY。4．4scFv蛋白的纯化、复性和浓缩本试验重组蛋白c端加入了His—Tag标签，所以选用Ni-NSTHis．BindResin进行亲和纯化样品，操作简单，重复性好，纯化后SDS．PAGE检测纯化效果良好。常用的复性方法包括色谱复性、超滤复性以及透析复性，最适的复性pH值一般在8．0．9．0。本试验采用脲梯度透析复性，基础透析液为PBS，依次在4M尿素、2M尿素、1M尿素、0．75M尿素、0M尿素中进行透析，全程在4。C进行，使用磁力搅拌器每个步骤透析4h。目的蛋白经过10kDa超滤管浓缩，并做缓冲液的置换，置换缓冲液为pH7．4PBS，得到2．6mg／mL的目的蛋白。43 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体问接ELISA检测方法的建立4．5scFv活性的测定检测seFv活性的方法包括间接ELISA、竞争ELISA和Westernblotting等。scFv没有Fc片段，不易于普通的酶标二抗结合：但本试验scFv带有His标签，所以在Westernblotting检测中，可利用鼠源抗6xHis标签单抗与HRP标记山羊抗小鼠IgG结合的特点，进行免疫检测。本试验通过Westernblotting验证了复性scFv的活性，并通过间接ELISA方法确定scFv稀释度在1：5120(O．51肛g／mL)时仍可以与鲫鱼IgM发生特异性结合反应。 第二篇试验研究第三章鲫鱼IgM单链抗体融合基因的构建和表达参考文献【l】WilsonMR,WartGW．Fishimmunoglobulinsandthegenesthatencodethem【J】IAnnualReviewofFishDiseases，1992，2：201—221．【2】陈丛琳，孙小云，廖兰杰，等．利用抗草鱼IgM的单链抗体分析草鱼呼肠孤病毒的免疫原性【J】．中国科学：生命科学。42(12)：986．992．【3】K．Dai，H．Zhu,C．Ruan．GenerationandcharacterizationofrecombinantsinglechainFvantibodythatrecognizesplateletglycoproteinIbtt[J】．ThrombosisResearch，2003，109(203)：137．144．【4】X．Hu，R．O’Dwyer,J．G．Wall．Cloning，expressionandcharacterisationofasingle-chainFvantibodyfragmentagainstdomoicacidinEscherichiacoli【J】．JournalofBiotechnology，2005，120(1)：38-45．[5】A．Sheikholvaezin，P．Sandstr"‘orfl，D．Eriksson,eta1．Optimizingthegenerationofrecombinantsingle-chainantibodiesagainstplacentalalkalinephosphatase【．r1．Hybddoma,2006，25(4)：181．192．[6】LeisyDJ,LewisTD，LeongJA，eta1．TransductionofCulturedFishCellswithRecombinantBaculovirus【J】．JournalofGeneralVirology，2003，84(5)：1173-1178．【7】徐佳，韩宗玺，杨光．抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定叨．中国预防兽医学报，2009，3l：800．804．【8】霍萍萍，张聪敏，赵宝华．单链抗体制备技术及应用的研究进展[J】．细胞与分子免疫学杂志，2011，27(10)：1154．1156．45 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立PREPARATIONOFSINGLE．CHAINFRAGN蜊TSVARIABLEANTIBODY(scFv)AGAINSTIgMFROMCRUCIANCARPSABSTRACT：Inthestudy，weattemptedtoconstructscFvfromthemonoclonalantibodywhichWaSpreparedandpreservedinlaboratory．ThetotalRNAWaSabstractedfromthehybridomacellwhichWaSsecretinganti·IgMantibody．andOligodTWaSemployedasthereverseprimertosynthesizethefirstchainofeDNA．VHandVLgeneswereamplifiedbyPCR,andthegeneswereclonedintothepMD19Tvectortotestthesequences．Followedsplicingbyoverlapextension，linker(GIy4Se04WaSleadedinbetweenVHdownstreamandVLupstream，therebygettingtheF3a-scFvgene．ThentheF3a-scFvgenewasrecombinedintheprokaryoticexpressionvectorpET32a．AfteritWaSprovedtobecorrectbyenzymedigestionandsequencing，therecombinantplasmidWaStransformedintoEscherichiacoliRosetta(DE3)pLysS．SDS-PAGEanalysisshowedtheexpectedproteinbandwiththemolecularweightof45kDa．TherecombinantproteinWaShighlyeffectivelyexpressedwitIltheformofinclusionbody．ThentheF3a-scFvproteinWaSrenaturatedby4-0mol／Lureagradient．Afterconcentratcdby10kDaMillipore，theconcentrationofF3a-scFvwaSupto2．6mg／mL．TheindirectELISAandwesternblottinganalysesdemonstratedthattherecombinantproteinhaSgoodimmunoreactivity．Keywords：single—chainfragmentsvariable；mAb；IgM；sequenceanalysis 第二篇试验研究第四章嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立第四章嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立摘要：为了有效地监测鱼类疫苗的免疫效果及疾病的感染情况，本试验以灭活嗜水气单胞茵为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鲫鱼IgM单链抗体为酶标二抗，通过反应条件的优化建立了检测鲫鱼血清中IgM抗体水平的间接ELISA方法。实验所确定的间接ELISA最佳反应条件为：包被抗原最适工作浓度为108cfu／mL，最佳包被条件是4"C过夜；一抗(血清)最佳稀释度为1：160；最佳封闭条件是以5％脱脂奶，37。C封闭1．5h；抗原抗体最佳作用时间为1．5h；酶标二抗最佳作用稀释度为l：50，作用时间为lh；TMB底物显色条件为28℃温育10min。以OD450值>0．0963判为阳性，样品OD450值<0．0831时判为阴性，0．0831姘品OD值<0．0963时判定为可疑。敏感性试验显示当血清稀释度达1：2560时，阳性样品检测结果仍为阳性，表明所建立的间接ELISA方法敏感性较好。批次内重复性试验的变异系数在1．2％．5．3％之间，批次间重复性试验的变异系数在1．36％．6．7％之间，均小于10％，表明所建立的间接ELISA方法重复性和稳定性良好。运用已建立的间接ELISA方法检测鲫鱼不同免疫和感染时期血清中IgM抗体的水平，结果显示：免疫组和感染组10d前的血清抗体水平均为阴性，10d开始呈现上升趋势，免疫组在35．40d时血清IgM抗体水平达到最高，而感染组在30．35d时达到最高，此后两组的血清IgM抗体水平开始下降；直到60d时，免疫组IgM抗体水平仍较高，而感染组检测结果也仍为阳性。关键字：IgM；抗体水平；间接ELISA；嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一种典型的人．兽．鱼共患病病原，广泛分布于自然界中，可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类动物，人的感染会造成食物中毒及腹泻，是我国淡水鱼养殖业暴发性传染病的主要病源之一，给水产养殖业造成了巨大的经济损失it,2】。鲫鱼是我国淡水养殖的主要品种之一，分布广泛，养殖规模大，食用人群很多。嗜水气单胞菌给鲫鱼养殖带来的危害最为严重。目前对鲫鱼疾病的防治措施主要是使用抗生素，这也导致了耐药病原菌的出现[31。目前，血清中抗体效价的高低已经成为反映水生动物免疫水平较为理想和可靠的指标【41，建立快速、敏感而准确的检测血清中抗体水平的方法不仅有利于流行病学的调查，对于疫苗的改进也十分重要。本试验通过建立间接ELISA检测方法，测定嗜水气单胞菌不同感染和免疫时期47 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接EUSA检测方法的建立鲫鱼血清中IgM抗体的水平，为深入了解鱼类特异性体液免疫机制、疫苗的效果评价及流行病学调查提供帮助。1实验材料1．1实验动物及菌株鲫鱼购自南京禄口渔场，259／1君，饲养于150L水箱，28℃水温饲养两周稳定后，用于试验。嗜水气单胞菌J．1株由本实验室陈怀青等分离鉴定保存。1．2主要试剂及实验仪器包被缓冲液：0．05MpH9．5的碳酸盐缓冲液Na2C031．599NaHC032．939+蒸馏水至1L10×PBS-NaCl809KH2P042．79KCl29Na2HP04‘12H2035．89+蒸馏水至1L调pH为7．4稀释液及洗涤液：含0．5960吐温．20的1xPBS封闭液：含5％脱脂奶粉的PBST终止液：2mol／LH2S04可溶性TMB底物显色液购自TIANGAN；ISA763A佐剂由法国SEPPIC公司惠赠。Model550型酶标仪为美国BioRad公司产品；酶标条购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。2实验方法2．1全菌抗原的制备新鲜的AhJ一1株接种于LB培养基中，28"C180rpm培养24h，13000rpm离心lmin，弃上清后沉淀以灭菌PBS重悬，加入终浓度为O．5％的福尔马林，28℃灭活 第二篇试验研究第四章嗜水气单胞菌抗体问接ELISA检测方法的建立24h。次日，以平板培养法检查灭活效果，确定彻底灭活后，13000rpm离心lmin，弃上清以灭菌PBS洗三次后，调节终浓度为lx109cfu／mL的浓度，4℃保存备用。2．2血清的制备2．2．1阳性血清的制备取健康鲫鱼20尾，以全菌抗原与ISA763A佐剂7：3混合乳化，腹腔注射免疫鲫鱼，109cfu／mL，0．1mL／尾，共免疫三次，每次间隔10d。于三免后15d尾静脉采血，鱼血于37℃温育1h后，置4。C过夜使血清充分析出，次日以4"C3000rpm离心20min，分离血清，小量分装后于．20℃保存。2．2．2阴性血清的制备取健康鲫鱼20尾，饲养30d后尾静脉采血，分离血清，经间接血凝试验检测未见凝集现象后，用作阴性血清样品，于．20。C保存。2．2．3不同免疫时期鲫鱼血清的制备取健康鲫鱼77尾，分为对照组(22尾)和免疫组(55尾)。对照组用灭菌PBS腹腔注射，0．1mL／尾；免疫组以全菌抗原与ISA763A佐剂7：3混合乳化，腹腔注射免疫鲫鱼，109efu／mL，0．1mL／尾，免疫三次，每次问隔10d。免疫组和对照组分别在初免后3d、7d、10d、20d、25d、30d、35d、40d、45d、50d、60d尾静脉采血，免疫组每次采集5尾，对照组每次采集2尾，分离血清，于．20℃保存。2．2．4不同感染时期鲫鱼血清的制备健康鲫鱼77尾，分为对照组(22尾)和感染组(55尾)。对照组用灭菌PBS腹腔注射，0．1mL／尾：感染组以嗜水气单胞菌活菌以7x108cfu／mL腹腔注射，0．1mL／尾。感染组和对照组分别在感染后3d、7d、10d、20d、25d、30d、35d、40d、45d、50d、60d尾静脉采血，免疫组每次采集5尾，对照组每次采集2尾，分离血清，于．20℃保存。2．3间接ELISA实验操作步骤2．3．1全菌包被抗原的制备 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立将2．2．1制备的全菌抗原经超声波破碎，401-1z工作5sec，问隔10see，破碎60次，悬液即为全菌包被抗原。2．3．2包被将制备好的包被抗原以包被缓冲液稀释，100pL／-孑LJJIIA酶标孔板，置4"C包被过夜。2．3．3封闭弃去包被液，PBST洗板3次，5min／次，拍干。以350“L／孔加入封闭液，37"C作用4h。2．3．4加鱼血清(一抗)弃去封闭液，PBST洗板3次，5min／次，拍干。每孑L；OIJ入适当稀释度的阳性和阴性血清，100刖孔，37。C作用2h。2．3．5加HRP．scFv(二抗)弃去孔内液体，PBST洗板3次，5min／次，拍干。每孔加入1：50稀释的HRP．scFv，100．aL／孑L，37℃作用lh。2．3．6显色和终止弃去孔内液体，PBST洗板3次，5min／次，拍干。加入TMB底物显色液，100I．tL／孔，室温避光反应15min后，加入50rtL终止液终止反应。2．3．7结果判定用酶标仪测定OD。50值，判定结果。每次试验设置空白对照(一抗为蒸馏水)，样品测定的OD450值减去空白对照OD450值即为真正的样品OD值。待检样品(P)／IjYJ性样品CN)>2．1时，待检样品为阳性，反之为阴性。2．4间接ELISA最佳反应条件的选择2．4．1包被抗原和一抗最佳工作浓度的选择将制备的全菌包被抗原用pH9．6的碳酸盐缓冲液稀释成109cfu／mL、108cfu／mL、107cfu／mL、106cfu／mL四个浓度梯度，每个浓度做两行；将阳性和阴性参考血清分别作1：10，1：20，1：40，l：80，1：160，1：320稀释，每个稀释度加一竖排；利用方 第二篇试验研究第四章嗜水气单胞菌抗体间接EIISA检测方法的建立阵形式按照2．3的方法进行间接ELISA。测定oD450值后，以阳性血清平均OD值1左右，阴性血清平均OD值0．1左右，P／N>2．1且最大时的包被抗原浓度为包被抗原最适工作浓度，该点对应的血清稀释度为血清最适工作浓度。2．4．2抗原最适包被条件的选择选择两种包被条件进行试验，分别是37℃作用2h和4。C包被过夜，以抗原最适工作浓度包被酶标孔板，照2．3的方法进行间接ELISA，读取OD450值，比较两种包被条件下阴性、阳性血清的OD450值和P／N值，以P／N最大的确定为最适包被条件。2．4．3封闭液和封闭时间的选择以抗原最适工作浓度和包被条件包被酶标孔板，以I％BSA、2％BSA、5％脱脂奶作为封闭液，确定封闭液后设37℃lh、1．5h、2h、2．5h四个封闭时间进行间接ELISA，反应结束后读取OD450值，比较各组阴性、阳性血清的OD450值和P／N值，以P／N最大的确定为最适封闭液和封闭时间。2．4．4一抗血清最佳反应时间的选择以抗原最适工作浓度和包被条件包被酶标孔板，以最适封闭液和封闭时间进行封闭，加入最佳工作浓度的阴性、阳性血清，设三个作用时间，分别为1h、1．5h、2h，进行间接ELISA程序，比较各组阴性、阳性血清的OD450值和P／N值，以P／N最大的确定为最适抗原抗体作用时间。2．4．5酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择以最适条件完成包被、封闭和一抗的作用，将酶标二抗(HRP．scFv)做1：50、1：100、1：200、1：400的稀释；设酶标二抗反应时间三组，分别为1h、1．5h、2h。完成ELISA程序后，比较各组阴性、阳性血清的OD450值和P／N值，以P／N最大的确定为酶标二抗最佳稀释度和作用时间。2．4．6显色时间的确定以最适条件完成包被、封闭、一抗和二抗作用，加入TMB底物显色液，在28。C设5min、10min、15min、20min作为显色时间，测定OD450值，以P／N最大的确定为最适显色时问。2．4．7Cut-off值的确定5l 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞苗抗体间接ELISA检测方法的建立用已建立的间接ELISA方法检测健康鲫鱼血清50份，计算OD450均值(力和标准差(sD)，确定建立的间接ELISA方法的Cut-off值。2．5敏感性试验取嗜水气单胞菌免疫阳性血清，1：160倍比稀释至1：10280，用建立好的ELISA方法检测。2．6重复性试验2．6．1批次内重复性试验采用同一批制备的包被抗原包被酶标孔板，取5份不同的阳性血清和l份阴性血清，用已建立的间接ELISA方法检测，每份样品重复5孔，进行统计学分析。2．6．2批次间重复性试验取5份不同时间制备包被好的酶标孔板，取5份不同的阳性血清和l份阴性血清，用已建立的间接ELISA方法检测，结果进行统计学分析。2．7不同免疫及感染时期鲫鱼IgM抗体水平的检测用已建立的间接ELISA方法，检测不同免疫时期和不同感染时期鲫鱼血清中IgM抗体水平。3结果3．1间接ELISA最佳反应条件的选择3．1．1包被抗原和一抗最佳工作浓度的确定以方阵法确定包被抗原和一抗的最佳工作浓度，如表4．1所示，当包被抗原浓度为108cfu／mL，一抗血清抗体稀释度为1：160时，阳性血清OD450值接近1．0，阴性血清OD450值约为0．1，且P／N值达到11．580，所以确定抗原最适工作浓度为108cfu／mL，血清最佳稀释度为1：160。52 第二篇试验研究第四章嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立表4．1包被抗原和血清最佳工作浓度的选择Table．4-1Determinationoftheoptimalantigenconcentrationandantisemdilution3．1．2抗原最适包被条件的确定对两种包被条件下阳性血清和阴性血清的OD450的比值进行分析(表4．2)，可见4℃包被过夜的P／N值更大，所以选择4℃包被过夜为包被条件。表4-2包被条件的确定Table．4-2Optimizationofthecomingcondition3．1．3封闭液和封闭时间的确定分别以1％BSA、2％BSA和5％脱脂奶进行封闭，完成间接ELISA。结果显示(表4．3)，选用5％脱脂奶时，P／N最大。 鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立以5％脱脂奶在4个不同时间条件下进行封闭，完成间接ELISA。结果显示(表4-4)，以5％脱脂奶37*(2封闭1．5h和2h时，P／N值相差不大，所以选择封闭时间为1．5h。表4-3封闭液的选择Table．4-3Optimizationoftheblockingsolutions封闭液BlockingsolutionI％BSA2％BSA5％脱脂奶表4-4封闭时间的选择Table．4-4Determinationoftheoptimalblockingtime3．1．4一抗血清最适作用时间的确定一抗血清分别作用1h、1．5h、2h进行间接ELISA，结果显示(表4—5)，一抗血清作用1．5h时，P／N最大，选作最适作用时间。表4．5一抗血清最适作用时间的选择Table．4-5Determinationoftheoptimalincubationtimeofserum一抗作用时间Reactiontimeofserum1h1．5h2h阳性血清(P)0．7100．9841．084阴性血清(N)0．0370．0350．055P／N19．0228．5219．713．1．5酶标二抗最佳稀释度和作用时间的选择 第二篇试验研究第四章嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立将酶标二抗以1：50、l：100、1：200、l：400的稀释度分别进行间接ELISA，结果表明(表4．6)，酶标二抗稀释度为l：50时，P／N最大。以1：50加入酶标二抗，分别设作用时间为1h、1．5h、2h，结果表明(表4．7)，酶标二抗作用时间为lh时，P／N最大。所以酶标二抗最佳稀释度为1：50，最佳作用时间为1h。表4．6酶标二抗最佳稀释度的确定Table．4-6Determinationoftheoptimaldilutionofenzymelabeledantibody酶标二抗稀释度Dilutionofenzymelabeledantibody1：50l：1001：200l：400表4．7酶标二抗最佳作用时间的选择Table．4-7Determinationoftheoptimalreactiontimeofenzymelabeledantibody酶标二抗作用时间Reactiontimeofenzymelabeledantibodylh1．5h2h3．1．6显色时间的确定加入TMB底物显色液，分别于28℃作用5min、10min、15min、20min，结果表明(表4．8)，作用10min时，P／N值最大，为最佳作用时间。表4-8显色时间的确定Table．4．8Determinationofincubationtimeofsubstrate显色时间Incubationtimeofsubstrate5rain10min15min20min3．1．7Cut．off值的确定55 鲫鱼IgM单链抗体的制各及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立50份健康鲫鱼血清的01)450均值z为0．05664，标准差sD为o．013222，确定间接ELISA阳性临界值为z+3SD=0．0963，阴性临界值为以z+2SD=0．0831；所以样品OD450值芝O．0963判为阳性，样品OD450值