嗜水气单胞菌的分离培养及鉴定

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1、万方数据第33卷／第2期／2009年3月河北师范大学学报／自然科学版／JOURNALOFHEBEINORMALUNIVERSITY／NaruralScienceEdition／V01．33No．2Mar．2009嗜水气单胞菌的分离培养及鉴定李楠’．-，孙讳敏1一，田莉瑛1，李晓明2，申红旗3，王风敏3，李全振3，曹杰英3，赵宝华2(1．河北化工医药职业技术学院制药工程系，河北石家庄050026；2．河北师范大学生命科学学院．河北石家庄050016；3．河北省水产局病当监测站，河北石家庄050011)擒要：从患腹水病

2、褐牙鲆体内分离致病菌，通过生理生化鉴定方法对该菌进行了鉴定．根据Genbank上报道的嗜水气单胞菌标准株的16srDNA序列以及致病性嗜水气单胞菌所含有的气溶素(uer)基因没计了2对引物．对所分离到的2株疑似菌以及3株标准株进行PCR扩增，均能够扩增出目的条带，经测序后，该菌的16srDNA的序列，aer序列与标准株同源性分别达到99．8％和95％．与常规细菌鉴定方法所得结果一致，证明该菌为嗜水气单胞菌．关键词：嗜水气单胞菌；分离；鉴定；腹水；16srDNA中围分类号：S941．42文献标识码：A文章编号：100

3、0．5854(2009)02．0240．04嗜水气单胞菌(Aeromonas

4、Il州rophila)普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分．致病性菌株对水产动物、家畜和人均有致病作用，在动物疾病学和食品卫生学研究上都具有重要意义⋯．近年来嗜水气单胞菌引起我国水产动物细菌性败血症的流行，危害严重，造成了巨大的经济损失，已成为我国水产养殖中所关注的问题【2“J．牙鲆(Paralichthysolivaceus)是珍贵的经济鱼类之一。尤其在我省渤海海域，是大规模工厂化养殖的优势经济特

5、色品种．但是随着高密度工厂化养殖技术的迅速发展和海水污染的日益严重，腹水症、败血症和寄生虫病等大规模暴发流行，引起牙鲆的大批死亡．嗜水气单胞菌既是恒温动物与变温动物的条件致病菌，又是原发致病菌【71．但是，Austin等【8】报道嗜水气单胞菌通常在自然界是条件致病菌，充当继发病原而不是原发病原．因此，环境的污染和养殖密度的提高，极易引起嗜水气单胞菌病的大规模暴发．据余德光等【9]报道，5～10月肠型嗜水气单胞菌引起海水鱼类肠炎病流行，常见于卵型鲳鱼参、军曹鱼、大黄鱼、红鳍笛鲷等海水鱼类．病鱼肠道充血出血，严重时引起

6、全身坏血症而死亡．本文中，笔者建立了一种嗜水气单胞菌的分子生物学检测方法，不仅克服了传统菌种鉴定中耗时长、手段繁琐、延误病情治疗的缺点，并具有更加快速、敏感、准确的特点，适宜在实际生产中进行大范围推广．1材料实验用鱼由唐山会达水产养殖公司、唐山普林海珍、唐山十里海紫天养殖场提供．实验菌株分离自患病褐牙鲆8株，疑似嗜水气单胞菌；嗜水气单胞菌标准菌株由南开大学惠赠．2实验方法2．1形态学及生理生化鉴定2．1．1发病症状及触片检查唐山普林海珍、唐山会达水产养殖公司部分牙鲆鱼出现腹部膨胀，严重者有充血的肠脱落于肛门之外，伴

7、有肌肉以及背鳍尾鳍等处大面积出血，吻发红，腹部发红；患病鱼食欲不振．精神萎靡．每日均有大批死亡．取病死牙鲆及濒死牙鲆腹水涂片及肠积水触片，经瑞氏染色后镜检观察．收稿日期：2008—08—16；修回日期：2008一ll一20基盒项目：河北省重点科技攻关项目(06780503)作者简介：李椭(1981一)．女．河北肃宁人．硬士．主要从事徽乍物学研究．通讯作者：赵宝华(1967一)，男．教授．研究方向为微乍物学．E．nuail：zhaohaohua86178@sohu．oom万方数据·241·2．1．2病料采集对出现腹水

8、病症状的10尾褐牙鲆进行剖检，采集病料，分别将病变肝脏、睥脏、肠等置于事先灭过菌的ep管中；用棉拭子将采取的腹腔积水、肠道积水等直接涂布于营养琼脂培养基上．2．1．3分离培养将采集到的病料直接置于普通营养琼脂平板或者液体LB培养基中培养16h，将菌液涂布于固体平板，培养单菌落．分别挑取单菌落进行纯培养，在血液琼脂平板和麦康凯琼脂平板上分别培养．2．1．4革兰氏染色及生理生化微量鉴定将培养所得单菌落进行革兰氏染色及接种生化管，按常规法进行氧化酶试验、运动性测定以及分解葡萄糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷、鸟氨酸脱羧

9、酶等生化试验．2．1．5耐药性检测测定筛选出来的疑似菌株对青霉素、痢特灵、四环素、卡那霉素、庆大霉素等各种抗生素的药物敏感性．2．2分子生物学检测2．2．1通过扩增16srDNA核苷酸序列鉴定利用嗜水气单胞菌在16srDNA这一保守序列中存在的可变区进行扩增，根据GenBank所报道的嗜水气单胞菌(ATC7966)全序列设计2条引物：P1为5LGAAAGGT