猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断elisa检测方法的建立

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分类号密级华中农业大学硕士学位论文猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立ProductionofMonoclonalAntibodiesandEstablishmentofBlockingELISAforDetectionofChlamydophilaAbortusinSwine研究生学号指导教师指导小组：闰少侠2010302110185栗绍文副教授周丹娜副研究员毕丁仁教授孟宪荣讲师李自力副教授石德时副教授刘梅副教授专业：预防兽医学授予学位名称：农学硕士研究方向：兽医公共卫生获得学位时间：华中农业大学动物医学院二。一三年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文迳如需保密，解密时闾年月目是否保密，lrolliiiiiiiiiiilJlliiiiiJ独创性声明Y2394890本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取褥的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含菇讴人i已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获稃华中农韭大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对虼进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说喷，并表示了谢意。研牲麟：闻夕伏时间：‰B年6月馋甚学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学装子保存、使用学位论囊的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文曲印刷版蠹电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文．本人同意华中农韭大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的金部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换骧务，璃时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文(帮涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在器要鬟交保密韵论文)在解密后运窟予本授权书。学位论嫦祧名：嘲乡伏导师戤：喙矧签名日期：年月日签名日期：如露年占月／％ 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯iAbstract⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ii缩略语表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．iii1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1衣原体概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1衣原体分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2主要生理特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．1．3衣原体危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2猪流产嗜性衣原体病研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．1临床症状及病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2治疗与预防⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．3主要抗原蛋白研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l。2。4流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．3猪流产嗜性衣原体检测技术研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．3．1传统检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．3．2分子生物学检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．3．3血清学检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4研究目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1O2．1．1病原、血清、细胞及试验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．3试剂配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．4主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．2．1猪流产嗜性衣原体MOMP克隆表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122t2。2MOMP单克隆抗体制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．2．3单克隆抗体酶标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．2．4阻断ELISA抗体检测方法建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯163结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．1MOMP克隆表达结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．173．1．1目的基因扩增及分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173．1．2诱导表达与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文3．1．3Western-Blot检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203．1．4间接ELISA包被浓度与血清稀释度选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203．1．5临界值确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯213．2MOMP单克隆抗体制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．213．2．1小鼠免疫后效价检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯213．2．2杂交瘤细胞染色体计数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯213．2．3亚型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．2．4腹水效价检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．2．5腹水纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．3单抗酶标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．4阻断ELISA抗体检测方法建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。233．4．1参考血清效价检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．4．2抗原包被及酶标单抗工作浓度选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．4．3血清稀释度选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．4．4酶标单抗反应时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．4．5血清反应时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．4．6临界值确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．4．7交叉反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．4。8重复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．4．9符合性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．4．10稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯284讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．294．1抗原蛋白的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯294．2表达载体的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304．3单克隆抗体制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯304．4阻断ELISA方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。305结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33附录1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39附录2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40Ⅱ 猪流产嗜性农原体单抗制各及阻断ELISA检测方法的建立摘要流产嗜性衣原体(Chlamydophilaabortus，C．abortus)是引起猪、牛、羊等家畜流产、死胎等繁殖系统疾病的重要病原体，每年给畜牧养殖业造成重大的经济损失。同时，作为一种重要的人畜共患病原体，也给人类的公共卫生安全带来严重的危害。近几年来的猪场流行病学调查结果表明，我国猪场中衣原体流行相当普遍。目前，猪场中都没有使用衣原体疫苗进行免疫预防，因此检测血清中抗体可以作为该病临床诊断的重要依据。因此，本研究利用重组MOMP蛋白和单克隆抗体建立一种快速、简便的阻断ELISA抗体检测方法，为临床检测提供技术支持。1．猪流产嗜性衣原体MOMP克隆表达以猪流产嗜性衣原体HBl043株的全基因组DNA为模板，设计特异性引物进行PCR，扩增得到全长的MOMP基因，连接T载体并测序。对基因序列进行分析后，选择271．1176bp进行克隆表达。构建重组表达质粒pET-28a．MOMP，转化BL21进行诱导表达，并采用镍离子亲合层析柱对表达产物纯化，得到34kDa的重组蛋白，经Western-Blot检测证实重组蛋白具有免疫学活性。2．MOMP单克隆抗体制各使用甲醛灭活的衣原体鸡胚卵黄囊液离心后的上清与弗氏佐剂混合作为免疫原，免疫6周龄BALB／e小鼠。经三次免疫后，使用重组MOMP蛋白间接ELISA方法检测血清效价。当血清效价达到1：3200时进行融合，使用间接ELISA方法筛选阳性克隆。最后筛选出5株特异性强、可以稳定传代的杂交瘤细胞株：5D7、1D3、4E5、1E6、4C9。进一步鉴定结果表明，5D7和1E6的亚型分别为IgGl和I903，其余三株亚型均为IgG2b；腹水效价为105．106。采用辛酸硫酸铵法对效价较高的两株单克隆抗体的腹水进行纯化，最后用HRP进行标记。3．阻断ELISA抗体检测方法的建立以重组MOMP作为抗原包被ELISA板，以酶标4C9株单抗作为酶标物建立阻断ELISA抗体检测方法。经试验优化后选择的反应条件为：蛋白稀释80倍，待检血清2倍稀释，酶标单抗32000倍稀释作为最佳工作浓度。结果判定的临界值为0．377。用现行标准检测方法IHA与建立的阻断ELISA方法同时检测261份血清，两种方法的总体符合率为78．5％；阳性符合率为85。6％；阴性符合率为62．5％。关键词：流产嗜性衣原体；MOMP；单克隆抗体；阻断ELISA；抗体检测 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文AbstractChlamydophilaabortus(C．abortus)isanimportantzoonoticpathogenwithbroadhostspectrums，whichmainlycausesthereproductivedisorders，particularlyabortionandendometritis．Recentyears，prevalenceofCabortusinswinehadbeenreportedinlotsofcountries．Efficiemvaccinehadnotbeenused，SOantibodydetectionisstillalleffcctivemethodtomonitoranddiagnosetheinfection．Inthisstudy，aripedandsimpleBlockingELISAfordetectionofantibodiesagainstCabortuwasdeveloped．1．CloningandexpressionofMOMPproteinofC．abortusCompletemompgeneofC．abortusHB1043s1／”dinwasamplifiedbyPCRandclonedintopMDl8-Tvector．ThegenesequenceWaSanalyzedandtheimmunologicfragmentof271．1176bpWaSclonedintopET-28avector．TherecombinantpET28a-MOMPplasmidwastransformatedinBL21toexpress．TheproteinWaspurifiedwithNisepharose6fastflowanditsreactivitywasdetectedbyWestern-blot．2．Productionofmonoclonalantibodies(McAbs)againstMOMP6-weekBALB／cmicewereimmunizedwiththeimmunogenwhichpreparedbymixingtheformaldehyde-inactivedC．abortus-infectedchickenembryoyolksacsupernatantfluid、Ⅳi出theFreund’Sadjuvant．TheindirectELISAbasedonrMOMPproteinwasusedtomonitortheantibodytiter．35daysafterimmunized，themicewhichhadthetallestantibodytiterWasselectedtofuse，HybridomasupematantsforantibodyproductionwerescreenedbyindirectrMOMP-ELISA．After3timescloning，5hybridomacelllinessecretingmonoclonalantibodies(McAbs)aghastMOMPwereselectedandnamedas5D7，1D3，4E5，1E6，and4C9．Thefurtherstudiesindicatedthatthesubtypesof5D7and1E6wereIgGlandIgG3，respectively；thesubtypesofotherswereIgG2b．Theantibodytitersoftheascitesfluidswerel0s．106．TheMcAbswerepurifiedbyoctylicacidammoniumsulfatemethodandwerelabeledwithHRP．3．EstablishmentoftheBlockingELISATheBlockingELISAwasestablishedbyusingtherMOMPasthecoatingantigenandusingtheHPR-labeledMcAb4C9aSthecompetiveantibody．Themostsuitabledilutedconcentrationofthecoatingantigen，serulllsampleandtheHPR-labeledMcAbwere1：80，1：2and1：32000，respectively．1heCUT-OFFvaluewasO．377．26IselxlinsamplesweredetectedWiththeIHAandtheBlockingELISA，andthediagnosiscoincidencerateofthetwomethodsWas78．5％．Keywords：Chlamydophilaabortus；MOMP；MeAb；BlockingELISA；AntibodyDetectionll 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立缩略语表缩写名称英文全称中文全称AmpAmpicillin氨苄青霉索bDbasepair碱基对BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白C．abortusChlamydophilaabortus流产嗜性衣原体DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DTT1，4-Dithiothreitol二硫苏糖醇EBElementarybody始体E∞／／Escherichiacoli大肠杆菌EDTAEthylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸ELISAEnzymelinkingimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验HATHypoxathino．aminopterin-thymidine次黄嘌呤．氨基碟呤-胸苷HTHypoxathine-thymidine次黄嘌呤一胸苷HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IPTGIsopropylthio．肛D．galactoside异丙基硫代一B-D一半乳糖苷IgGImmunoglobinG免疫球蛋白GIgMhmtmoglobinM免疫球蛋白MKDKilodalton千道尔顿KanKanamycin卡那青霉素LBLuria-bertanimediumLB培养基LPSLipopolysaccharide脂多糖MMarker分子量标准McAbMonoclonalantibody单克隆抗体MOMPMajoroutermembraneprotein主要外膜蛋白NCNitrocellulo∞filter硝酸纤维素膜ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放阅读框PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液PEGPolyethyleneglycol聚乙二醇POMPPolymorphicoutermembraneprotein多形态外膜蛋白RBReticulatebody网状体SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳uLmicroliter微升 猪流产嗜性衣原体单抗制各及阻断ELISA检测方法的建立1前言1．1衣原体概述衣原体是一类能够引起人和多种动物患病的专性细胞内寄生人畜共患病原微生物。衣原体具有广泛的宿主群，可以引起结膜炎、肺炎、关节炎及肠道疾病等。孕妇和怀孕母畜感染流产衣原体后可导致流产、死胎(Wileelhouseetal2012)。世界上大部分国家和地区都曾有衣原体流行的报道，衣原体对人类的健康造成了严重的危害，同时给畜牧养殖业带来重大的经济损失(SchautteetandVanrompay2011)。1．1．1衣原体分类关于衣原体的分类命名一直存在很大的争议。1948年，依据衣原体不能在宿主细胞外繁殖增殖的特性将其归为立克次氏体目，农原体科。衣原体科包括：衣原体属、宫川氏体属、轲赖氏体属。这个分类命名法提出来之后的二十年里，几乎每年都有一种新的分类命名法出现。1968年，Storz等根据其专性细胞内寄生及其独特的双变相发育周期的特点，提议将其划分为一个单独的目即衣原体目，包括一个属即衣原体属(Storzetal1968)。依据衣原体对磺胺类药物的敏感性不同以及网状体内糖原积累量不同而导致的碘染色结果不同将其分为两个种，即沙眼衣原体和鹦鹉衣原体。沙眼衣原体对磺胺类药物敏感且碘染色呈阳性，而鹦鹉衣原体正好相反。同时，这两个种之间的基因序列比对结果显示同源性比较低(Pilhoferetal2008)。1999年，Everett等对衣原体的16SrRNA与23SrRNA基因序列进行系统进化树分析后，认为衣原体目包含四个科。其中衣原体科包括两个属：衣原体属和嗜性衣原体属。衣原体属包括：猪衣原体、鼠衣原体和沙眼衣原体；嗜性衣原体属包括：鹦鹉热嗜性衣原体、流产嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体、肺炎嗜性衣原体、猫嗜性衣原体和豚鼠嗜性衣原体等(Everett1999)。2001年，Bush和Everett对编码主要外膜蛋白的基因ompA，一个伴侣蛋白基因GroEL，富含半胱氨酸的60kDa大蛋白基因omp2，富含半胱氨酸的脂蛋白基因omp3以及2．酮．3．脱氧D．甘露型辛酮糖酸转移酶的基因kdtA等的序列进行系统进化树分析，其结果支持以上分类方法。这种分类方法充分考虑了宿主范围、临床症状以及毒株的毒性等，同时可以用基于16S．23SrRNA问区的PCR-RFLP方法对新分离到的衣原体株进行快速的分类鉴定。这种分类方法为大部分动物衣原体病研究者所采用，但是在人类医学领域这个分类法还是遭到普遍的抵制，存在争论的焦点是衣原体科是否应该分为两个属。还有一些争论是其未考虑不同毒株在生物学以及生态学之间的关系等(BushandEverett2001；Rode}lakisandYousef2010)。 华中农业大字2013届倾士研冗生学位论文1．1．2主要生理特性衣原体经革兰氏染色呈阴性，呈圆形或椭圆形，大小0．2．1．0gm，可以通过细胞滤器。衣原体具有内含DNA的致密类核结构，具有核糖体和较为复杂的酶类，能进行多种代谢，但是缺乏代谢所需的能源，需要依赖宿主细胞提供ATP进行自身代谢活动(Rohdeetal2010)。衣原体对多种抗生素敏感，如四环素类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素等。但是由于抗生素药物的滥用，最近己有关于耐药性病原株的报道(BinetandMaurelli2009)。在室温下，一般10d完全丧失感染力，56。C时25rain，100。C时15min灭活。普通的消毒液均可杀灭衣原体，如1％盐酸2-3min，75％酒精lmin，0．1％甲醛24min(CorsaroandGreub2006；曲江和王长贺2010)。衣原体的繁殖过程是一个双变相的循环过程。这个循环的增殖过程包括两个形态和生理特性不同的原体(Elementarybody，EB)和网状体(Reticulatebody，RB)aEB具有侵染性但是不具有代谢活性，RB具有代谢活性但是不具有侵染性。在衣原体的传播感染过程中，EB黏附于宿主细胞表面，侵染进入细胞内开始增殖，形成具有代谢活性的RB。一般经过48．72h的生长可以形成一个内含多个EB的RB。随着RB的扩张增大，最后宿主细胞膜破裂，EB从RB中释放出来进入周围环境进行下一次侵染、传播(Rohde2010；FarrisandMorrison2011)。1．1．3衣原体危害沙眼衣原体对人的危害主要是沙眼以及由生殖道和淋巴肉芽肿变型引起的性传播疾病。最近几年也发生了流产嗜性衣原体感染孕妇导致流产的病例。有报道称生殖道和淋巴肉芽肿引起的性传播疾病已经超过淋病和梅毒，成为感染人数最多的性病。其他嗜性衣原体属感染人以后引起的症状主要有感冒类似病症、肺炎、结膜炎等(Marinoetal2008；LanjOUWetal2010)。衣原体对畜牧养殖业的危害，主要是引起猪、牛、羊等家畜发生流产、死胎等繁殖类疾病。不同年龄段的家畜均可感染衣原体，其表现症状不同。1．8月龄的幼羊主要表现为关节炎、结膜炎等；6月龄以前的犊牛、仔猪主要表现为肺炎；怀孕的猪、牛、羊主要表现为流产；种公畜主要为睾丸炎、尿道炎等(Pelletieretal2006；田廷图等2008)。鹦鹉、鸽子及猫等家庭饲养的动物也是衣原体的易感动物，这种与人类密切接触的动物都是人类潜在的病原感染源(O’Shea2010)。近年来，欧洲研究人员对野生动物中衣原体的流行病学调查显示，野生动物中衣原体的流行状况也不容乐观，其与家畜的交叉传播也是衣原体得以大范围传播扩散的重要原因(Salinasetal2009；RodolakisandYousef2010)。2 猪流产嗜性衣原体单抗制各及阻断ELISA检测方法的建立1．2猪流产嗜性衣原体病研究进展流产嗜性衣原体在1999年以前一直被命名为鹦鹉热衣原体血清型I。随着分离出的病原株越来越多，对衣原体的致病性及临床症状研究的深入，研究人员发现所有血清型I的鹦鹉热嗜性衣原体都是从自然流产的胎盘或者胎体器官分离到的，同时这个血清型与其他血清型病原株在易感动物、感染力、致病性及持久性等方面均存在明显的不同。利用现代分子生物学技术研究结果也表明，血清型I的毒株与鹦鹉热衣原体的基因组序列同源性在27％．85％之间，而且基因组序列中的限制性内切酶位点存在很大的差异(MohamadandRodolakis2010)。Everett等对衣原体的16SrRNA与23SrRNA基因序列进行系统进化树分析，同时根据其MOMP基因序列中限制性酶切位点的不同，从鹦鹉热衣原体中分离出三个新的衣原体种即流产嗜性衣原体、猫嗜性衣原体和豚鼠嗜性衣原体(Everett1999)。目前从猪体分离的衣原体株有猪衣原体、流产嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体和鹦鹉热嗜性衣原体。其中以流产嗜性衣原体居多，是引起母猪流产、死胎等造成重大经济损失的主要病原体。流产嗜性衣原体可以感染猪、牛、羊、马、兔、鼠等，同时与患病动物密切接触的孕妇也可能导致流产(SchautteetandVanrompay2011)。1．2．1临床症状及病理变化流产嗜性衣原体感染后，妊娠母猪临床症状主要表现为流产、死胎、弱仔及围产期仔猪大量死亡等。流产一般发生在怀孕中晚期，流产率一般在20％-90％不等。妊娠母猪防治的难点主要在于流产前母猪并无明显的临床症状，采食量和体温等均正常。分娩后有些母猪由于胎衣滞留，导致继发性细菌性子宫内膜炎引起死亡。公猪感染后主要表现为睾丸肿胀、尿道炎、附睾炎等。种公猪精液品质下降，受配母猪受胎率降低等。仔猪感染后主要表现为体弱、精神不振、食欲差，发育不良，死亡率高等(Amin2003；王雪峰和王保民2009)。病猪的病理变化主要表现为流产母猪子宫内膜充血、水肿，有散在大小不等的坏死灶；流产胎儿水肿，头颈部、四肢出血，肝脏坏死肿大；公猪睾丸肿大、变硬，阴茎肿大、出血，部分病猪腹股沟淋巴结发炎肿大等(夏道伦2010；SchautteetandVanrompay2011)。1．2．2治疗与预防猪流产嗜性衣原体病的治疗一般采用四环素、强力霉素、土霉素、金霉素、泰乐菌素等抗生素类药物，首选四环素(Smithetal2005)。配种前1—2周，母猪产前2．3周随饲料拌喂四环素类制剂可以有效预防流产、死胎等。出现临床症状的仔猪肌注l％的土霉素lmg／kg，连用5d。在衣原体流行期，在饲料中拌喂土霉素，可以有效预防群体发病(邱昌庆等2003；李雪2009)。科学饲养管理，建立良好的卫生 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文安全体系是预防疾病的重要手段。对发病猪的妥善处理，对环境进行彻底的消毒灭菌是防止衣原体扩散传播的保证。注射疫苗是动物疾病防控的主要措施(徐浩天等2009：mLAJ．Sobayiletal2012)。我国在20世纪70年代研制的羊流产衣原体灭活疫苗，有效控制了衣原体病对养羊业的危害。20世纪80年代，兰州兽医研究所和广西兽医研究所研制成功的猪流产衣原体灭活苗，对预防猪的衣原体病取得了很好的效果(周继章和邱昌庆2007)。近年来，基因工程疫苗研究得到很好的发展，研究人员基于多种疫苗载体构建了衣原体MOMP多种基因疫苗。端青等利用鹦鹉热嗜性衣原体MOMP构建的基因工程亚单位疫苗已经获国家发明专利和农业转基因生物安全证书，其中鸡用疫苗于2006年获国家一类新兽药证书和生产批准文号，羊用疫苗已申报新药并被受理(端青2006)。1．2．3主要抗原蛋白研究进展随着现代分子生物信息学技术的发展，对流产嗜性衣原体的研究有了很大的进展。研究人员已经对流产嗜性衣原体的分类及免疫保护性等在基因水平上进行了深入研究。Thomson等完成了对流产嗜性衣原体$26／3株的全基因组测序工作，大小为1，144，377bp，包含961个编码框(Thomsonetal2005)。对衣原体基因组的研究主要有：16SrRNA和23SrRNA及它们的问区序列；免疫保护性抗原基因编码的蛋白，如39kDa的主要外膜蛋白(MOMP)、分子大小不等的85、90和105kDa的多形态外膜蛋白(POMP)、热休克蛋白60(HSP60)(Vandahletal20021Sturdevantctal2010；Wheelhouseetal2012)。还有一些应用衣原体人工攻毒的免疫血清鉴定的抗原蛋白如12kDa和60kDa的富含半胱氨酸的小蛋白和大蛋白、27kDa的类似巨噬细胞蛋白以及包涵体膜蛋白Inc766(Meonietal2009：Fan-isandMorrison2011)。近几年来，研究人员对衣原体与宿主的互作机理研究结果显示，包涵体膜蛋白及效应蛋白在衣原体的侵染及致病等过程中发挥着重要作用(Sturdevantetal2010)。Buendia等采用免疫显微镜检技术研究血清I型鹦鹉热嗜性衣原体的两个抗原蛋白80—90kDa的POMP和l10kDa的MOMP多聚体的免疫保护性及其蛋白定位区域。结果表明：POMP及MOMP均具有免疫保护性，但是POMP主要存在于RB的外膜表面，而在EB中则存在于胞质内表面：MOMP则在RB和EB的表面均为优势蛋白(Buendiaetal1997)。Longbottom等利用免疫电子显微镜检测技术研究了羊源流产株鹦鹉热嗜性衣原体OMP90家族蛋白的定位。实验中使用了针对OMP90氨基端和羧基端的特异性单克隆抗体以及POMP和MOMP的特异性单克隆抗体。结果表明，90kDa的POMP蛋白存于EB的外膜表面(Longbottometal1998)。Hoelzle等利用一个阿拉伯糖操纵子的表达质粒同时克隆表达了流产嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体和猪衣原体三种重要病原体的全长MOMP以及切除掉信号肽序4 猪流产嗜性衣原体单抗制各及阻断ELlSA检测方法的建立列的MOMP，并用相应的EB和rMOMP免疫兔子，收集血清检测各种蛋白的免疫学活性。结果表明：信号肽严重影响表达产物的免疫学活性，而且能够使表达产物转移到大肠杆菌外膜表面；EB免疫后的血清与三种rMOMP抗原之间有明显的种间特异性反应；rMOMP免疫后的血清与三种rMOMP及EB之间则有明显的交叉反应(Hoelzle2003)。杨琪等将猪流产嗜性衣原体omp．1全长基因克隆到载体pcDNA3．1中，构建了DNA疫苗，并与重组蛋白rMOMP进行组合免疫。结果表明：用DNA疫苗和重组蛋白组合免疫可以引起机体较高水平的体液免疫和细胞免疫，而且首次免疫用DAN疫苗，二次免疫用重组蛋白的效果相对较好(杨琪等2007)。刘伟等将流产嗜性衣原体omp．1全长基因克隆k．NMll49噬茵体构建DNA疫苗并研究其免疫效果。结果表明：重组的DNA疫苗在免疫后的初期不能显著诱导出高水平的抗体，但是免疫后29d开始血液中抗体水平开始升高，且T淋巴细胞增生明显。结果表明LNMl149噬菌体具有潜在的增强免疫效果的作用(刘伟等2008)。栗绍文在研究猪流产嗜性衣原体的基因免疫实验中将猪IL-2和IFN．1，插入构建的真核表达质粒PCI-MOMP进行共表达，并通过免疫小鼠研究其免疫效果。将枸杞多糖作为免疫佐剂与PCI．MOMP共同免疫小鼠，研究其对免疫效果的影响。实验结果表明：猪IL．2和IFN吖两种细胞因子没有观察到可以明显增强体液免疫和细胞免疫的效果。枸杞多糖可以显著增强体液免疫水平，但是没有增强细胞免疫的效果(栗绍文2008)。梅仕林等克隆表达了猪流产嗜性衣原体CP／12株的pomp90基因的部分片段，并进行了原核表达得到了重组蛋白，对该蛋白的反应原性进行了分析。结果表明：pomp90基因的1．1092bp片段特异性好，与其他种衣原体的同源性较低，而且经ELISA和Western-Blot检测具有良好的反应原性(梅仕林等2008)。1-2．4流行病学1955年美国人Willingan首次从患有心包炎的猪病料中分出衣原体。随后世界各种陆续出现关于衣原体感染母猪引起流产、死胎等疾病报道。2000年以来流产嗜性衣原体对养猪业的危害越来越严重，逐渐得到了人们更多的关注。最近几年关于衣原体对养猪场的流行病学调查报道表明，猪场中的衣原体抗体阳性率普遍较高(Eggemannetal2000；Camenischetal2004；Bagdonasetal2005)。我国从80年代开始关注和研究猪衣原体病。杨宜生等在国内首先报道猪衣原体病，他们从流产母猪和多发性关节炎仔猪的病料中分别分离出衣原体(杨宜生1982)。90年代后，猪衣原体感染呈上升趋势。我国各省均有衣原体感染猪导致流产、死胎等的报道，而且衣原体血清学调查报告显示各省规模化猪场中衣原体血清学检测结果阳性率普遍较高(周继章和邱昌庆2007)。邱昌庆等对河北省衡水地区 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文某规模化猪场的猪衣原体病进行检测阳性率为35％(邱昌庆等2000)。高双娣等对甘肃省7个市(地)的部分猪场猪群用间接血凝试验进行衣原体血清抗体检测，468份猪血清，总阳性率达34．4％，个别地区的阳性率高达67％(高双娣等2003)。白挨泉等使用间接血凝试剂盒对广东部分地区10个猪场的衣原体抗体检测结果显示，抗体阳性率为14．3％．94．1％不等，平均阳性率为66．4％(白挨泉和冯国金2004)。索绪峰等对海南省13个猪场972份血清抗体检测结果显示猪场整体抗体阳性率为49．5％，其中母猪群抗体阳性率为53．66％(索绪峰等2005)。最近几年，我国各地关于猪场中衣原体的血清学调查结果显示，大部分的猪场中衣原体的抗体阳性率呈逐年升高的趋势，而且由于人们对衣原体的忽视，防治措施不到位，而且随着不同地区间引种及贸易的加强，衣原体的流行状况势必更加严峻。陆文俊对广西省不同地区猪场进行衣原体流行状况调查，结果显示：所有检测的地区，衣原体抗体均有阳性，平均阳性率为20．77％。其中具有流产史的21个猪场中有14个抗体检测呈阳性，血清总体阳性率为51．04％。同时采用PCR检测及鸡胚分离培养出2株鹦鹉热嗜性衣原体(陆文俊2006)。魏润生对甘肃省一个发生母猪流产、死胎，公猪睾丸肿胀等症状的猪场进行检测。采用染色镜检、细菌培养及血清检测等方法，初步判定布氏杆菌为阴性，衣原体为阳性。采用PCR方法检测7份病料，结果均为阳性(魏润生2008)。梅仕林用建立的POMPl间接ELISA法对广东、河南、安徽、湖北四省18个猪场的968份临床猪血清进行了检测。结果表明，17个场猪流产嗜性衣原体抗体呈阳性，阳性率10．O％．83．3％(梅仕林2009)。张烨芬对云南省宣威市一个规模化养猪场引进的40头种猪发生流产、死胎的进行诊断。实验室检测6份病猪血清结果显示布氏杆菌、猪细小病毒以及伪狂犬等均为阴性，采用IHA检测衣原体为阳性。据以上判定这次发病有衣原体引起。该病在宣威市疫病史无记载，属首次发生衣原体感染(张烨芬2010)。M．J．XU等采用IHA法对广东省15个集约化养猪场的1071份血清进行了检测。结果表明，14个场的猪血清中衣原体抗体呈阳性，平均阳性率30．78％。阳性率最高的是种公猪(63．38％)，其次为繁殖母猪(41．10％)，最低的是育肥猪(36．25％)(XUetal2010)。田德雨等对北京郊区5个规模化养猪场不同猪群及饲养人员进行了流行病学调查。采用间接血凝试剂盒和法国ELISA试剂盒检测抗体，采用直接免疫荧光法检测抗原。结果表明两种抗体检测试剂盒的阳性率分别为4．14％并W2．17％；抗原平均阳性率为14．8％，其中种公猪精液阳性率为37．5％，母猪生殖道拭子阳性率为27．5％，饲养人员喉头拭子阳性率为23．5％(田德雨等2012)。6 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立1．3猪流产嗜性衣原体检测技术研究进展流产嗜性衣原体在猪群的感染非常普遍，但却没有得到相应的重视。从猪场技术人员到实验室的研究都没有把衣原体当做一种严重的病原体加以对待。究其原因主要有以下三方面：一是衣原体引起的疾病及其临床症状没有特异性。其与猪场常见的一些可以引起流产、死胎等繁殖障碍的传染病症状相似。二是衣原体不是一种常规检测病原。大部分研究人员以及猪场技术人员在做流行病学调查时，对衣原体的检测不在考虑范围之内。三是缺乏一种快速、简便、价格合理的检测方法。1．3．1传统检测传统病原学诊断方法主要是病原的分离培养，包括细胞配养，鸡胚卵黄囊接种等。细胞培养法主要使用的细胞系有McCoy、Vero、HeLa、BHK21细胞等(Muller-Loenniesetal2006；Petyaevetal2010)。由于其结果相对可靠，并且重复性好等，一直被认为是检测病原体的“金标准”方法(Mukhopadhyayetal2004)。但是细胞培养法检测病原体的敏感性较低、特异性不好，而且检测周期长、工作量大、判定结果主观性性等，研发新一代检测方法成为必然(Longbottometal2002)。1。3．2分子生物学检测现代分子生物学检测方法主要是PCR检测。分子生物学诊断由于其特异性强、敏感性高等优点，从而在病原微生物的临床检测方面得到广泛应用。流产嗜性衣原体的16SrRNA和23SrRNA序列、MOMP、POMP基因等基因片段是各种PCR检测方法靶基因片段。这些方法主要有简单PCR、多重套式PCR、巢式PCR以及real．timePCR等(Hoelzleetal2003；Berrietal2009)。国内对流产衣原体的分子生物学检测方法主要有：苗振川等(1999)基于MOMP基因建立的用于检测羊流产嗜性衣原体的普通PCR方法。李应国等根据猪衣原体、鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体的ompA基因序列建立的多重套式PCR。该方法可以同时检测属特异性基因片段和猪衣原体、鹦鹉热衣原体或者肺炎衣原体种特异性片段，实现了单管同时检测多种病原，降低了抗原检测的成本和工作量(李应国等2009)。1．3．3血清学检测血清学检测一直是临床检测大量样品和动物流行病学调查的首选方法。动物衣原体的血清学检测方法主要有补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、直接荧光抗体检测试验、问接荧光抗体检测试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。ELISA在多种动物疾病的检测和流行病学调查中，因为其具有方便、快速、成本低等优点得到广泛应用(Longbottometal2002；Wilsonetal2009)。 华中农业大学2013届坝士研冗生学位论文我国现行动物衣原体诊断的标准方法是2002年由农业部畜牧兽医局提出，兰州兽医研究所起草。该标准规定中的直接补体结合试验(DCF)主要适用于除猪以外的哺乳动物和鹦鹉、鸽衣原体病的进出境检验检疫以及定性诊断；间接补体结合试验(ICF)主要适用于禽鸟(鹦鹉、鸽除外，但是包括老鸽)和猪衣原体病的进出境检验检疫以及定性诊断；间接血凝试验(IHA)适用于动物衣原体病的产地检验、疫情监测和流行病学调查(邱昌庆等2002)。CFT法虽然在世界大多数国家和地区作为标准参考方法，但是这种方法存在操作繁琐、敏感性低、与其它一些革兰氏阴性菌存在交叉反应等缺点(Vretouetal2007；Wilsonetal2009)。Salti．Montesanto等用两个特异性的单克隆抗体建立了竞争ELISA来检测血清中鹦鹉热嗜性衣原体和家畜嗜性衣原体抗体。用灭活的相应衣原体的EB包被ELISA板，血清中特异性抗体与单克隆抗体竞争结合于EB。通过检测临床血清并与MOMP的间接ELISA及CFT的检测结果比较，证明这种竞争ELISA可以方便快速的鉴别检测出特异性的鹦鹉热嗜性衣原体和家畜嗜性衣原体抗体(Salfi—Montesantoetal1997)。Longbottom等用克隆表达的四个不同的POMP90蛋白包被ELISA板，建立了一种用于检测羊血清中流产嗜性衣原体抗体的间接ELISA方法。通过检测SPF羊血清及临床血清，与CFT及POMP91B间接ELISA的结果比较，其敏感性和特异性都明显好于这两种方法。更重要的是该检测方法可以避免家畜嗜性衣原体感染引起的交叉反应(Longbottomctal2002)。Hoelzle等利用表达的流产嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体和猪衣原体重组MOMP蛋白分别建立了间接ELISA，研究重组的MOMP作为诊断抗原是否具有种间特异性。实验结果表明：重组的MOMP与同源的免疫衣原体血清具有明显的反应，而异源的血清只有很微弱的反应或者不反应。表明重组的MOMP可以作为种特异性的抗原进行衣原体抗体血清学诊断(Hoelzleetal2004)。张焕容等以德国衣原体标准株(B394)的属特异性抗原为检测抗原，包被于诊断膜片，用辣根过氧化物酶标记的葡萄糖球蛋白A蛋白(PPA)为酶标记物建立了Dot-PPA．EusA方法，用于检测猪血清中衣原体抗体(张焕容等2007)。栗绍文以猪流产嗜性衣原体CP／12株为研究对象，克隆构建了MOMP及POMP90四个不同大小片段的五种质粒，并进行原核表达得到五种重组蛋白。利用纯化的五种蛋白作为检测抗原分别建立间接ELISA抗体检测法。结果显示：POMP90作为检测抗原效果优于MOMP，而四种POMP90所建立的间接ELISA方法特异性较好(栗绍文2008)。 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立Wilson等对以EB、裂解病原纯化的衣原体外膜(SolPr)、POlVlP-3和POMP-4为包被抗原建立的四种间接ELISA进行评价和比较。通过与CFT及商品化试剂盒ImmunoComb、CHEKIT、Pourquier的检测结果比较这四种方法的灵敏性、特异性等。试验结果显示：EB、SolPr和CHEKIT与CFT的检测结果差异不大，特异性均不好，存在与家畜嗜性衣原体抗体的交叉反应；ImmtmoComb的检测结果也存在与家畜嗜性衣原体抗体的交叉反应，而且还有部分假阳性结果；Pourquier、POMP-3和POMP．4的特异性是几种方法里面最好的，但是Pourquier在检测临床阳性血清时灵敏度不够高；综合比较来看，POMP．3作为包被抗原建立的ELISA是这几种方法里面特异性最好(100％)，与阴性血清及家畜嗜性衣原体抗血清均无交叉反应，而且灵敏度可以达到96．8％(WilsOBetal2009)。Salinas等以CFT和PourquierELISA为参照标准，利用衣原体属特异性HA5C5McAb和流产嗜性衣原体特异性JA6C7McAb分别建立了阻断ELISA抗体检测法，灵敏度分别为93。7％和91。6％。并利用两种阻断ELISA对西班牙的8种野生动物血清中抗体进行了检测(Salinasetal2009)。1．4研究目的与意义我国从二十世纪80年代发现衣原体对猪的感染以来，不断有关于猪场中衣原体流行病学调查的报道。近几年文献报道的猪场中衣原体血清抗体的阳性率比以前有趋高的形势，而且有些地方是初次发病，说明衣原体在猪场的流行愈加严重。然而这种情况却没有得到相应的重视。猪流产嗜性衣原体的检测方法主要是IHA，但是这种方法在临床大规模样品的检测及基层兽医工作中的应用有一定的局限性。近几年的研究结果显示，阻断ELISA具有方便、快速、特异性强等优点，在多种动物疾病的临床检测中已经大量普及使用。国内还未见有应用单克隆抗体建立阻断ELISA检测猪流产嗜性衣原体抗体的报道。本研究拟选择性克隆表达猪流产嗜性衣原体MOMP，制备特异性的单克隆抗体，并建立猪流产嗜性衣原体阻断ELISA检测方法，为猪衣原体病的诊断提供技术支持。同时作为一种人畜共患病原体，防控流产嗜性衣原体对于人类的健康安全也具有重要的公共卫生学意义。9 华中农业大学2013届坝士研冗生字位论文2材料与方法2．1试验材料2．1．1病原、血清、细胞及试验动物猪流产嗜性衣原体HBl043株，E．coliDH5。E．coliBL21、SP2／0，湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保存；衣原体阴、阳性血清，兰州兽医研究所IHA试剂盒：新西兰大自兔、BALB／e小鼠，湖北省疾病控制中心实验动物中心。2．1．2主要试剂猪衣原体IHA诊断试剂盒，购自兰州兽医研究所；克隆载体pGEM．T，购自PROMEGA公司；原核表达载体pET．28a由本实验室保存；限制性内切酶BamHI和SalI、T4DNA连接酶、DNAMarker以及PCR反应试剂等均购自大连宝生物公司；蛋白Marker购自FERMENTS公司；细菌基因组提取试剂盒购自BioerTechnology；凝胶回收试剂盒购自杭州爱思迸生物技术有限公司：DNA片段回收试剂盒购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒购自OmegaBio．Tek；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；镍离子蛋白亲和层析柱购自GE公司；二硫苏糖醇(DTT)、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、尿素等购自洁洋盛生物科技有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT干粉、HT干粉、8．氮鸟嘌呤、融合剂50％PEG购自SIGMA公司：RPMI．1640、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司：二甲基亚砜(DMSO)、青链霉素溶液(100×)、液体石蜡等购自碧云天生物技术有限公司；HPR-标记羊抗小鼠IgG、小牛血清白蛋白组分V(BSA)、秋水仙素等购自SIGMA公司；快速ELISA小鼠单克隆抗体分型试剂盒购自ThermoScientificPierce公司；FastlinkA型酶标试剂盒购自GalaxyBio公司。2．1．3试剂配制LB液体培养基：胰蛋白胨109，酵母浸出粉59，NaCl59，溶于800mL双蒸水，10 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立pH7．4，加双蒸水定容至1000mL，121"C高压蒸汽灭菌15rain，室温保存备用。LB固体培养基：在以上LB液体培养基中加159琼脂粉，配制方法同上。缓冲液A(用于包涵体提取)：Tris．HCl50mM／L，EDTA0．5mM／L，NaCl50mM／L，甘油5％，DTT0．5mM／L(临用时加入)。PBSBuffer：NaCl137mM／L，KCl2．7mM／L，Na2HP0410mM／L，KH2P042mM／L，HCI调pH值至7．4，室温保存。Western-Blot试剂：电转缓冲液：39mM／L甘氨酸，48mM／LTfis碱，0．037％SDS，20％甲醇；TBS(pH8．O)：10mM／LTris．HCI，150mM／LNaCl；TBST：含0．05％Tween-20的TBS；封闭液：1％BSA的TBST；ELISA试剂：包被液：pH9．6的碳酸盐缓冲液；洗涤液：含吐温-20终浓度O．5‰的PBSpH7．4；稀释液：含BSAl％的PBS；封闭液：含BSA0．1％的PBS。1640完全培养基：78mLRPMI．1640基础培养基，2mL青链霉素贮存液，20mL胎牛血清；8。氮鸟嘌呤(100×)、HAT盐溶液(50×)、HT盐溶液(50×)：无菌注射器取10mLRPMI．1640基础培养基于HT盐干粉的瓶中，溶解后4"C保存；HAT培养基：98mLRPMI．1640基础培养基，2mLHAT盐溶液；HT培养基：98mLRPMI．1640基础培养基，2mLHT盐溶液；饱和硫酸铵溶液：硫酸铵4008，溶于500mL双蒸水中，加热至70—804C，搅拌20min至完全溶解，4"C冰箱保存，临用前取28％的氨水将其调节为pH7．0。杂交瘤细胞冻存液：胎牛血清和DMSO以9：1的比例混合，4℃保存；0．06MpH4．8醋酸盐缓冲液(贮存液)：A、无水醋酸钠0．492189，加蒸馏水至lOOmL；B、冰醋酸O．344mL，加蒸馏水至100mL；用时取A液59mL，B液41rnL，调pH4．8；巴比妥缓冲液：氯化钠8．59，巴比妥O．5759，巴比妥钠0．3759，加水定容至200mL。2．1．4主要仪器PCR扩增仪，BIO．RAD；酶标仪，(XDS-1)；C02细胞培养箱，BINDER；台式水平离心机，TDL．40Bi分析天平，京六一仪器厂。BIO-TEK(ELX800)；倒置显微镜，COIC高速低温离心机，HITACHI(SCR20BC)；METTLER-AEl00S：电泳仪DYY一6C，北 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文2．2试验方法2．2．1猪流产嗜性衣原体MOMP克隆表达2．2．1．1衣原体全基因组提取取猪流产嗜性衣原体HBl043株感染鸡胚卵黄囊膜，加适量灭菌生理盐水充分研磨，取适量研磨液于1．5mL离心管，3000r／rain离心10min，取上清，再15000r／min离心30rain，取沉淀，按细菌DNA提取试剂盒的操作步骤提取基因组。2．2．1．2目的基因扩增设计两条引物，上游引物PI：TTA鱼丛匹￡ATGAAAAAACTCTl℃AAATCG，前加酶切位点BamHI；下游引物P2：GCq丑要鱼缒TTAGAATCTGAATTGAGC，前加酶切位点SalI。以上一步中提取的衣原体全基因组为模板进行PCR，反应体系：PCRMIX250L，上下游引物Pl、P2各0．5此，模板4止，ddH2020／．tL至总体积50止；反应程序：946C2rain，946C15s，58。C30s，72℃lmin，72℃10min，4"C10min。AxyPrep凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，产物4"C保存。2．2．1．3构建重组质粒pET-28a．MOMP酶切：BamHI和SalI对PCR回收产物及质粒pET-28a进行双酶切，反应体系：PCR产物酶切10×TBuffer6皿，BamHI2旺，SalI2止，PCR产物8皿，ddH2022止共40止；质粒酶切10×TBuffer15皿，BamHI4止，，SalI40．L，质粒20rtL，ddH2057血共100v．L。37℃水浴4h。采用DNA片段回收试剂盒对酶切产物进行回收。连接：10xT4LigaseBuffer2．5皿，T4Ligase1．5皿，MOMP酶切回收产物17曲，质粒酶切回收产物4皿共259L体系，4℃过夜。转化：从．704C冰箱中取200ⅢL感受态细胞DH5。悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；加入连接产物10此，冰上放置30min；42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5rain；向管中加入800止LB液体培养基，混匀后37。C振荡培养45min；5000r／min，3rnin，弃去上清400pL，重悬；取200“L上述菌液涂布于含Kan的LA平皿上，正面向上放置20rain后倒置平皿，37"C培养16．24h。待平皿上长出菌落时挑取菌落于含Kan的LB培养基中，37℃震荡4h，收集菌液，采用E．z．N．A．PlasmidMimiKitI试剂盒提取质粒。提取的产物用BamHI和SalI进行双酶切和测序鉴定，．20℃保存。2．2．1．4转化表达菌BL21将重组质粒pET．28a-MOMP转化表达茵BL21感受态细胞，转化方法见2．2．1．3。12 猪流产嗜性衣原体单抗制各及阻断ELISA检测方法的建立2．2．1．5诱导表达将上一步中转化成功的表达菌BL21接种到4mL含Kan的LB培养基中，按1：100的比例接种。37℃振荡3h：每瓶取出lmL留样作为诱导前的对照，然后加诱导剂IPTG至终浓度为1％，继续37"C震荡4h。SDS．PAGE电泳检测：摇好的菌液10000r／min，lmin，弃去上清，加入200p．LSDS-PAGE上样缓冲液，充分悬浮，煮沸10min；按SDS．PAGE使用说明配胶，凝固后加样各20此。80V，40min后120V至电泳完成。电泳完毕后取出胶块考马斯亮蓝染色过夜，脱色，观察蛋白表达情况。2．2．1．6目的蛋白纯化含Kaa的LB培养基200mL，1：100接种表达菌，诱导表达，方法同上。收菌，富集菌体，8000r／rain，5rain，于两个50mLEP管中；每管加BufferA20mL(用时加DTT)，重悬均匀；超声破碎，3min／次，间隔3min，需破碎大约10次左右；破碎好后12000r／min，10nlin；上清为包涵体上清，留存待检，沉淀加BufferA洗涤两次；每管各加20mL镍柱用平衡缓冲液(含8mol／L尿素)，4。C过夜。过柱纯化，操作步骤参见GE公司NiSepharose6FastFlow说明书。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。2．2．1．7Western．Blot检测将纯化的表达蛋白进行SDS-PAGE电泳后，取出胶块进行转膜，将两个蛋白泳道与各自相邻的Marker切下来，用尺子量出大小，同样的大小裁剪出6层重叠的滤纸；再裁剪出比之大约3-4ram的NC膜：将3层滤纸用转移液浸透后放在电转板上，将胶块放上，再加上NC膜，最后再加上剩余的3张滤纸，压平，盖好电转仪的盖子；接通电压，80mA，45min；转移结束后进行封闭，将NC膜放入加有封闭液的平皿中，振荡3h；加50倍稀释的衣原体阳性和阴性的猪血清，4。C过夜；TBST洗涤三遍，加二抗羊抗猪，37。C作用1h；洗涤三遍，加DAB显色液显色；最后用蒸馏水洗涤三遍。2．2．1．8间接ELISA抗原包被浓度及血清稀释度选择将纯化后的蛋白溶于pH9．6的碳酸盐缓冲液中，从1：10．1：320做倍比稀释包被ELISA板，阴、阳性血清从1：12．5．1：200作倍比稀释进行方阵ELISA选择最佳包被浓度和血清稀释度，初步建立ELISA抗体检测法。操作步骤参见参考文献32。 华中农业人学2013届硕士研究生学位论文2．2．1．9临界值确定挑选20份衣原体抗体检测呈阴性的猪血清，按照上一步确定的实验条件进行ELISA，计算平均值X，标准差SD：阴阳性临界值即为X+3SD。2．2．2MOMP单克隆抗体制备2．2．2．1小鼠免疫衣原体接种后致死的鸡胚卵黄囊液经甲醛灭活后离心取上清与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等量混合，乳化完全后作为免疫原。免疫方案如下：初免小鼠颈背部皮下多点注射；二免和三免腹腔注射，间隔均为两周。二免后7d和三免后7d断尾采血测效价。融合前3d采用不加佐剂的卵黄囊膜研磨液离心后上清腹腔注射加强免疫。2．2．2．2饲养细胞制备操作步骤参见参考文献32。2．2．2．3SP2／0，鲫胞制备细胞瓶中饲养的瘤细胞用10mL1640基础培养液洗脱，离心收集，2000r／min，5min；加10mLl640基础培养液重悬，稀释10倍计数，要求细胞总数1X107。2．2．2．4免疫脾细胞制备操作步骤参见参考文献32。2．2．2．5细胞融合操作步骤参见参考文献32。2．2．2．6阳性孔筛选融合后的第二天观察有无污染：第4d补加一滴HAT培养液；第8．10d吸弃100vL培养基，加100pLHT培养基；待融合细胞集落长至培养孔1／4，培养基略变黄时，采用间接ELISA法检测抗体。2．2．2．7杂交癌细胞克隆经间接ELISA检测呈阳性的细胞孔采用有限稀释法进行克隆。具体步骤如下：制备饲养细胞，于克隆的前一天晚上铺板，每孔一滴；用断头的2009L的枪头吹匀细胞，根据细胞量的多少进行计数；在96孔细胞培养板中，按照10个／孑L，5个／孔，1个／孑L，每个浓度4列；用含HT的完全培养基稀释至适当浓度后接种于一块培养板上。以后克隆均使用不含HT的完全培养基。置于培养箱中培养。一般4d后14 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立即可见到小的细胞集落，7d补液，10d后检测抗体。一般需克隆2．4次，直至出现集落的孔阳性率为100％。2．2．2．8杂交癌细胞染色体计数将杂交瘤细胞传代后36．48h处于生长对数期时加秋水仙素，终浓度为0．04pg／mL，继续培养5h；吹匀细胞后于10mL离心管中，1000r／min，10min，弃去上清液；加入已37。C预温的0．075mol／L的KCL低渗溶液5mL，吹打细胞使其悬浮混匀，37。C水浴15．20min；加入新配的固定液lmL，1000r／min，10min，弃上清；加固定液5mL，轻轻混匀，静置30min，1000r／min，10min，弃上清；再次固定，同上步；加固定液5mL，混匀，封管口，4。C过夜：1000r／min，10min，弃上清，留下0．5mL上清，混匀，用滴管吸取细胞悬液自10．20cm高处滴在4"C预冷的载玻片上，立即吹散，使细胞平铺其上，自然干燥；10％Giemsa染色10min，用自来水洗去染液，自然干燥：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察计数。每个细胞株计10个细胞的染色体数，计算平均值。2．2．2．9单克隆抗体亚型分析采用快速ELISA小鼠单克隆抗体分型试剂盒检测单抗亚型。操作步骤参见说明书。2．2．2．10单克隆抗体大量制备选8周龄的BALB／c小鼠，灭菌液体石蜡腹腔注射，O．5mL／只；7d后，选取处于对数生长期的杂交瘤细胞，0．5mLRPMI．1640基础培养液重悬，5．0x106个／只，腹腔注射；10d后抽取小鼠腹水，1500r／min，10min，收取上清。2．2．2．11腹水效价检测检测腹水上清效价，采用2．2．1中建立的间接ELISA法。2．2．2．12腹水纯化辛酸硫酸铵法：5mL腹水加适量二氧化硅，混匀，加等体积巴比妥缓冲液，室温振荡1h；静置30min；4'C，12000r／rain，15min；弃沉淀，上清中加两倍上清体积的醋酸缓冲液，调pH4．5：边搅拌边加正辛酸33“L／mL(原腹水体积)，室温搅拌30min；4"C，静置2h，使其充分沉淀；4℃，12000r／min，30mira取上清，0．459m滤器过滤后加体积的1／10的10xPBS，调pH7．4；边搅拌边加入同体积的饱和硫酸铵溶液(用前氨水调pn7．4)；46C，静置lh；4。C，12000r／min，30min，弃上清；沉淀用pH7．4PBS重悬溶解；透析除盐。对纯化后的单抗采用蔗糖浓缩，SDS—PAGE检测纯化效果。 华中农业大学2013届硕士研冤生学位论文2．2．3单克隆抗体酶标取适量单抗，用生理盐水调整浓缩后单抗浓度为lmg／mL。采用用GalaxyBio公司FastlinkA型酶标试剂盒进行HRP标记。具体操作步骤参见说明书。标记完成后，用重组的MOMP作为包被抗原，直接ELISA法检测酶标单抗的效价。2．2．4阻断ELISA抗体检测方法建立2．2．4．1猪流产嗜性衣原体参考血清制备采用流产嗜性衣原体HBl043株的鸡胚卵黄囊膜研磨液离心后的上清制备的油乳剂灭活苗作为免疫原，免疫新西兰大白兔3只，1只不免疫作阴性血清对照。每只兔子免疫前采血留样作对照。颈背部皮下多点注射，每次免疫间隔14d。采用初步建立的间接ELISA检测血清效价。2⋯242抗原包被及酶标单抗工作浓度选择将抗原蛋白MOMP按1：40．1：1280横向倍比稀释，4。C过夜，1％的BSA封闭，加2倍稀释的标准阴性血清和阳性血清，酶标单抗1：8000．1：64000竖向倍比稀释，进行阻断ELISA方阵实验。2⋯243血清稀释度选择根据方阵实验选择的蛋白浓度包被ELISA板，阴、阳性参考血清按0、2、4、8、16、32倍稀释，酶标单抗采用方阵实验选择的工作浓度进行阻断ELISA，其它条件不变，选择最佳血清稀释度。2．2．4．4血清反应时间选择采用选择好的蛋白浓度、酶标单抗工作浓度及血清稀释度进行阻断ELISA实验，其中加入阴、阳性血清后反应时间设置60、90、120、150min四个时间梯度，其它条件不变进行阻断ELISA选择最佳血清反应时间。2．2．4．5酶标单抗反应时间选择采用选择好的蛋白浓度、酶标单抗工作浓度及血清稀释度进行阻断ELISA实验，血清反应时间为上一步选择的最佳时间，加入酶标单抗后的反应时间分别设置10、20、40、60min四个时间梯度进行阻断ELISA选择酶标单抗最佳反应时间。 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立2．2．4．6临界值确定选择30份流产衣原体抗体阴性的猪血清，采用已确定的最佳反应条件进行阻断ELISA实验，同时设置参考阴、阳性和PBS对照各三次重复。分别计算30份血清的OD630值S与空白对照N的比值，计算其30份血清样品比值的平均值x和标准偏差SD，则临界值为：X--3SD。2．2．4．7交叉反应试验挑选对养猪业危害比较严重的传染病病原的标准阳性血清，与流产嗜性衣原体阳性血清同时进行阻断ELISA反应。本试验选取猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRv)、猪圆环病毒2型(PCV．2)以及猪流产嗜性衣原体的参考阳性血清。2．2．4．8重复性试验重复性包括批内重复和批间重复。同时包被一批ELISA板，同时检测同样的血清样品进行批内重复实验；不同的时间分别包被4次ELISA板，从每次包被的ELISA板里抽取包被板同时检测同样的血清样品。分别计算每次检测结果的平均值和标准差，计算其变异系数(CV)。2．2．4．9符合性试验用IHA与阻断ELISA同时检测261份临床血清样品，计算两种方法的符合率。2．2．4．10稳定性试验包被一批ELISA板分别放置于4。C和．20。C冰箱保存，每隔一个月检测一次同一批样品，检测四个月，比较检测结果。3结果与分析3．1MOMP克隆表达结果3．1．1目的基因扩增及分析以提取的衣原体基因组为模板，特异性引物P1、P2为引物进行PCR扩增目的蛋白MOMP的全基因片段，其产物进行琼脂糖凝胶电泳如图1所示。由图可知，目的条带大小为1200bp左右，大小正确，说明PCR扩增得到了MOMP的全基因片段。 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文12图1PCR产物电泳结果Fig．1ThePCRresultofgelelectrophoresis1DNA分子量Mal'kCl"，2PeR产物扩增产物连接T载体后，测序结果显示病原株HBl043的MOMP全长基因1176bp，基因序列已提交Genbank，基因登录号：Ⅲ4l1078。Blast结果显示，与流产嗜性衣原体CGl株，鹦鹉热嗜性衣原体GR9、GD、AviantypeC株碱基数相等，同源相似度为99％，其中与CGl株的同源相似度最高，只有一个碱基不同。蛋白氨基酸序列Blast结果显示，与流产嗜性衣原体CGl株的相似度100％，不同的一个碱基为无义突变；与鹦鹉热嗜性衣原体CTl、GR9株的相似度99％。Protean软件分析MOMP表面抗原位点如图2所示。从图中可看出第20．90位氨基酸残基之间的区段虽然抗原性位点较强但是其可能不是表面抗原位点，而在100位、240位以及345位氨基酸残基处抗原性较强，而且均可能为表面抗原位点。n．k头煎柏—△吒寸守屯嗉≯—L4幻畸刖图2MOMP表面抗原位点分析图Fig．2TheantigenityanalysispictureofMOMP根据SignalP3．0Server分析结果如图3，全部391个氨基酸残基中最有可能为信号肽的是前22个氨基酸残基。对序列进行限制性酶切位点分析，在271bp处为限制性内切酶BamHI位点，而且经此酶切位点切割后后续碱基序列的读码框并未受到影响。结合前面的分析结果，将此内切酶位点前的序列切除，选择271．1176bp构建重组载体进行选择性表达。～=一一一 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立SI口“●IP。"Hpr●d●c’tOMl口⋯⋯’⋯-●¨lC毋。厂——————————————了■]●’n001■n0p07’0‘0^‘’0dnnP-．1’ltr-图3MOMP全基因序列信号肽预测图Fig．3ThesignalpeptideanalysispictureoftheMOMP3．1．2诱导表达与纯化蛋白纯化过程中，收集的各阶段样品进行SDS．PAGE电泳检测结果如图4。从图中可以看出含有空载体pET．28的BL21组在诱导前后的蛋白表达情况基本上没有变化；而含有pET一28．MOMP重组载体的BL21组在经加入诱导剂IPTG后在34kDa大小处可以明显观察到有新的蛋白产生，其大小与目的蛋白rMOMP的预测大小一致，说明大量表达了目的蛋白；菌体经超声破碎后的上清中没有目的蛋白，说明目的蛋白是以包涵体形式存在的；3个不同咪唑浓度的洗脱液电泳结果说明咪唑浓度在100mMft时为最佳的洗脱条件；浓缩后的蛋白样品电泳条带说明经过纯化，蛋白溶液中的杂蛋白基本上被除去。经BCA试剂盒检测蛋白浓度为0．158mg／mL。12：{1567Hq10一I"i妻基冀翻图4重组蛋白原核表达及纯化后SDS-PAGE结果Fig．4SDS-PAGEanalysisofpET-28-MOMPexpressionandpurificationI蛋白分子量Marker，2-3空载体诱导前、后，4-5重组质粒诱导前、后，6菌体破碎后上清，7-9不同咪唑浓度洗脱液，10浓缩后蛋白液 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文3．1．3Western-Blot检测对纯化得到的rMOMP进行Western-blot检测，结果如图5。从图中可以看出rMOMP与流产嗜性衣原体的阳性血清发生反应，而与阴性血清不反应，说明得到的蛋白具有免疫学活性。图5Western-Blot检测结果Fig．5TheresultofdetectedbyWestern-Blot1，3．蛋白分子量Marker，2．阴性血清，4．阳性血清3．1．4间接ELISA包被浓度与血清稀释度选择方阵实验结果如表l，表2所示。选择阳性OD630值在1．0左右，阳性值与阴性值比值较高的稀释度作为最佳反应条件。依据以上要求本试验选取MOMP40倍稀释(3．951ag／mL)，血清50倍稀释为最佳稀释度。表1阳性血清方阵滴定结果Table1Checkerboardtitrationresultofpositiveserum 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立3．1．5I临界值确定20份猪流产衣原体抗体阴性临床血清检测结果的OD630平均值x为0．163，SD为o．052，临界值为X+3SD=0．32。表3阴阳性临界值选择Table3SelectionMasculineandthreshold3．2MOMP单克隆抗体制备3．2．1小鼠免疫后效价检测共免疫4只小鼠，第二次免疫后7d第一次断尾采血，采用初步建立的间接ELISA检测效价；三免后7d断尾采血，同样方法检测效价，结果如图6所示。从图可知，三次免疫后4号小鼠效价最高达到3200，选取4号小鼠进行融合。＼．、＼＼＼＼～1＼、～、。血清螭释7奇数图6免疫小鼠血清效价检测结果Fig．6Theantibodytitersofseraofthemiceimmunized3．2．2杂交瘤细胞染色体计数BALB／c小鼠脾细胞染色体数为40条，骨髓瘤细胞染色体数62．68条，杂交瘤细胞染色数一般在80．100条。挑选10个染色结果比较清晰的lo张图片计数，分别 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文为82、85、86、80、92、95、100、88、89、98条／个细胞，平均值为90．5条／个细胞，说明筛选得到的杂交瘤细胞是小鼠脾细胞和SP2／0细胞的杂交细胞。图7杂交瘤细胞染色体染色结果(100x)Fig．7Thestainingresultofthehybridoma(100x)3．2．3亚型分析小鼠抗体的亚型有IgA、IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3等6种。采用试剂盒对所筛选的5株杂交瘤细胞产生的单抗鉴定结果如表4所示。表4杂交瘤细胞亚型鉴定结果Table4TheisofomSresultofhyblridoma_____l____l__-_-_--_--_-_-__I_l___l____--__一细胞堡!里!!墅!兰!!墅垩型!璺g!!星竺!!璺竺!堡里垫!苎g：一3．2．4腹水效价检测使用初步建立的间接ELISA法检测5株单抗的效价结果如表6所示。从表中数据可知，亚型为IgG2b的4E5、4C9两株单抗效价最高，后续实验选择其中一株4C9进行纯化并进行下一步实验。表5腹水效价检测结果Table5Thetiterresultofascitesfluids细胞株G1(5D7)竺!!!!塑!堡丝!!墅!望!!!!竺!!塑!!墅!———●——————————————————————————————————————————————————————————————————————————一一鍪竺!：!!：!：!!一3．2．5腹水纯化采用辛酸硫酸铵法对收集的腹水进行纯化，纯化前与纯化后的SDS-PAGE结果如图8所示。纯化后的4E5、4C9两株单抗在50kDa左右有一条重链条带，25kDa左右有一条轻链条带，大小正确，而且纯化后杂蛋白基本被除去。 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断ELISA检测方法的建立3．3单抗酶标l2345豳’；叠盈患-t-三爹茹二图8腹水纯化后SDS-PAGE结果Fig．8SDS-PAGEanalysisofascitesfluidspurification1．蛋白分子量MaIk盯：2，4．纯化前腹水；3，5．纯化后腹水采用直接ELISA检测酶标后单抗效价，结果如表6所示。酶标后单抗4C9的效价为104，比腹水的效价低，但可以满足ELISA中作为酶标物的要求。BCA试剂盒检测单抗浓度为10mg／mL。表6单抗4C9经HRP标记后效价检测结果Table6TheliterresultofthemarkedMcAb4C9酶标单抗稀MOMP稀释度释度4080160320640128080002．297160002．209320001．905640001．4991．2510．6990．428O．2340．1781．0800．9280．6270．5850．44l0．3180．3340．2590．1940-2180．1490．1050．1660．1230．0841280000．9800．4420．2310．1510．098O．0833．4阻断ELISA抗体检测方法建立3．4．1参考血清效价检测兔子二免7d后第一次采血，采用间接ELISA检测血清效价，共采血4次，血清效价检测结果如图9所示。从图表可知，免疫的3只兔子中，l号和2号血清效价在四免后7d时达到最高值1600，3号兔子免疫效果不理想，血清效价最高值为400。23 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文20001500萋1000500O免疫前二免后7d三免后7d四免后7d五免后7d时问图9参考血清效价检测结果Fig．9Theantibodytitersofseraofthereferenceserum3．4．2抗原包被及酶标单抗工作浓度选择MOMP蛋白和酶标单抗的梯度方阵ELISA实验结果如表7所示。选择阴性OD630值在1．0左右，阴性值与阳性值比值较高的稀释度为最佳工作浓度。分析表中数据可知，蛋白选择80倍稀释(1．9751．tg／mL)，酶标单抗选择32000倍稀释为最佳工作浓度。表7蛋白包被浓度与酶标单抗浓度方阵ELISA结果Table7ThecheckerboardtitrationresultoftheproteinandthemarkedMcAb阳性血清阴性血清PBS对照8000160003200064000800016000320006400080001600032000640001．1700．8640．6080．5861．5801．2241．1420．7432．2031．7201．5981．02l0．8540．6130．4030．351．0870．9060．8720．5891．6411．3501．1960．8ll0．5200．3420．2330．2980．6940．5220．5940．3991．1390．8840．7720．6260．3690．2680．1880．1860．5230．3840．3390．2410．8670．6990．5970．3150．2980．1940．1450．1320．3490．2830．2440．16l0．6680．5680．5060．2260．207O．15l0．1lO0．1130．228O．164O．1780．1360．4140．3140．2840．15024 猪流产嗜性衣原体单抗制备及阻断EUSA检测方法的建立3．4．3血清稀释度选择6个梯度稀释的血清ELISA结果如图lO所示。从图中可知，随着血清稀释度增加，阳性结果逐渐升高；未加稀释的血清阴性值则偏低，因此选择血清2倍稀释为最佳稀释度。一T·，：÷t一一．。／血清稀释度图10血清工作浓度选择Fig．10Theresultoftheserumdilutedconcentration3．4．4酶标单抗反应时间酶标单抗不同作用时间的ELISA结果如图11所示。由图可知，阴、阳性血清及PBS对照的OD630值随反应时间延长逐渐升高。选择OD630值在1．0左右的反应条件即20min为酶标单抗的最佳反应时间。上-一工：专／‘：—y图ll酶标单抗反应时间选择Fig．11TheresultofthemarkedMcAbincubationtime3．4．5血清反应时间不同血清反应时间的ELISA结果如图12所示。从图中可知，反应时间小于90min时，阳性血清中抗体不能完全反应；90．120min范围内没有明显变化。为最大限度保证阻断反应的灵敏性，选择120min为血清反应时间。咖㈣瑚咖1O0O0蹭oo 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文T上下———二。——一j———一：}—————：—一‘、一一图12血清反应时间的选择结果Fig．12Theresultoftheseraincubationtime3．4．6临界值确定30份流产嗜性衣原体抗体阴性血清检测结果的OD630平均值x为o．677，标准偏差SD为o．10，则临界值为：X--3SD=0．377。结果判定标准为：样品OD630值S／阴性对照OD630平均值N，比值≥0．377为阴性；比值