猪流产嗜性衣原体Omp1基因及其重组蛋白免疫应答的研究

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1、摘要猪流产嗜性农原体是比较常见的导致猪流产等多种疾病的病原体。随着我国集约化养殖业的不断发展，猪流产嗜性衣原体的感染呈现上升的趋势，并造成重大经济损失。主要外膜蛋白(MajorOuterMembraneProtein，MOMP)是农原体膜表面的主要蛋白，具有重要的生物学功能，其保护性抗原的特点使MOMP成为衣原体外膜蛋白复合物中的研究热点。为初步探讨猪流产嗜性农原体momp基因(Omp．j)及其重组蛋白(RecombeniantMajorOuterMembraneProtein，r-MOMP)的免疫应答效果，本研究进行了如下试验：1．

2、以猪流产嗜性农原体cp／12株为研究对象，通过接种SPF鸡胚使该菌株得到增殖：用PCR法扩增猪流产农原体Omp．J基因，将特异性扩增片段克隆入pMDl8-T载体，筛选阳性克隆并测序；2．将Omp．J基因克隆入pET-32a表达载体，转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导重组菌表达重组MOMP蛋白，SDS．PAGE分析表达状况，Western-blot检测免疫原性；扩大化表达后，用不同浓度尿素溶液对包涵体进行洗涤、溶解并透析以溶解、纯化r-MOMP；3．通过酶切、连接将pMDl8-T-Omp．1上的Omp．1基因连接到pcDN

3、A3．1(+)真核表达载体上，构建Omp一1基因真核表达载体；4．将48只BalB／e小鼠随机分成8组后，用r-MOMP和pcDNA3．1．Omp一1分不同组别进行两次免疫，以空质粒、弗氏佐剂及弱毒疫苗免疫组做对照。二免后第14天采血分离血清，并分离脾淋巴细胞，以iELISA和T淋巴细胞增殖试验分别检测特异性体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示：①通过PCR法成功的扩增了猪流产嗜性衣原体cp／12株的Omp-1基因，与GenBank中4株流产农原体Omp．1基因和氨基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～8

4、8％，氨基酸序列也有较大差异；②通过大肠杆菌表达了分子量约为60KD的重组融合蛋白，Western．blot试验显示r-MOMP具有结合特异性抗体的活性，并获得了可溶性r-MOMP；③用构建的pcDNA3．1一Omp-1真核表达载体及纯化的r-MOMP免疫小鼠，观察到r-MOMP能够诱发高水平的抗体，pcDNA3．1一Omp．j能诱发中等水平的细胞免疫；先免疫核酸后免疫蛋白的效果好于先免蛋白后免核酸；同时免疫核酸与蛋白产生了相对较高的体液免疫与细胞免疫水平。试验表明Omp．1基囚在流产嗜性衣原体中具有保守性，是保护性抗原的编码基因。单

5、独免疫Omp一1基因和r-MOMP不能产生理想的体液免疫和细胞免疫。核酸和蛋白以不同组合能获得较好的效果，但这种免疫组合能够有效抵抗流产嗜性衣原体的感染仍需进一步研究。关键词：猪流产嗜性农原体，Omp．j，基因免疫，细胞免疫，体液免疫AbstractChlamydophitaabortushasbeenidentifiedasoneofthemajorepidemicdiseasesleadingtoabortionaswellasmanyotherdiseasesinswine．Withintensiveswinefarmincre

6、asinginrecentyears，Chlamydophilaaborms-relateddiseasesspreadwildlyinChinaandcauseahugeeconomicalloss．Themajoroutermembraneprotein(MOMP)，locatedonthesurfaceofChlamydia，hasbecomethenewfavourinchlamydialoutermembranecomplex(COMC)foritscharacteristicsofprotectiveantigenando

7、thersignificantbiologicalfunctions．InordertoillustratetheimmuneresponseofOmp-j(momp)andrecombinantMOMP(r-MOMP)，wehaveconductedthefollowingexperiments：1．ThestrainofChlamydophilaabortuscp／12waspropagatedinSPFeggembryos．AfterDNAextracting，Omp-jwasamplifiedbyPeR．Thespecific

8、productwasclonedintothepMDl8-TVectorforsequencingandanalyzing；2．Omp-JwasclonedintopET-32avector0ET-32a-momp)to