猪热激蛋白gp96n端基因与猪瘟病毒e2基因重组表达及重组蛋白的免疫原性研究

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1、密级：无论文编号:82110-2012-05中国兽医药品监察所项士学位论文猪热激蛋白Gp96N端基因与猪瘟病毒E2基因重组表达及重组蛋白的免疫原性研究TherecombinationandexpressionofporcineHSPGp96NgenewithE2geneofCSFVandtheimmunogenicityassayofrecombinantproteins研究生：龚文芝指导教师：宁宜宝申请学位类别：农学硕士学科专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗学位授予单位：中国兽医药品监察所2015年5月

2、独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容，也不包含为获得中国兽医药品监察所或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：年i月关于论文使用授权的说明本人完全了解中国兽医药品监察所有关保留、使用学位论文的规定，即：中监所有权

3、保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国兽医药品监察所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：时间：^°'y年6月乂曰中国兽医药品监察所硕士学位论文摘要摘要猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus,CSFV）的囊膜糖蛋白，可诱导动物体产生有效的免疫保护，是研究新型疫苗的主要对象。有研究表明，Gp96N端结构区的构象有α螺旋沟，该

4、区域与抗原肽结合能力强，形成的Gp96-抗原肽复合物非常稳定，有潜在的免疫佐剂作用。本研究将Gp96N（26AA-374AA）基因与E2全长基因通过口蹄疫病毒（FootandMouthDiseaseVirus,FMDV）2A基因进行融合，然后分别采用真核和原核系统对该重组基因进行表达，并对原核表达的重组蛋白进行免疫原性的测定以探究Gp96N（26AA-374AA）蛋白与佐剂效果。首先，将甲病毒复制子载体pSFV1进行改造，加入真核CMV启动子和终止区SV40polyA序列，获得一新的表达载体pSCA,然后

5、将EGFP基因、猪瘟病毒E2全长基因及Gp96N端与猪瘟病E2基因的融合片段分别克隆入pSCA载体中，获得pSCA-EGFP、pSCA-E2和pSCA-GE。转染后实验结果表明，pSCA-EGFP质粒能够得到有效表达，pSCA-E2、pSCA-GE能够得到表达，但是pSCA-E2、pSCA-GE质粒表达效率不高和平均荧光值偏低。其次，将E2基因与串联重组蛋白GE基因分别克隆入原核表达载体pET-32a（+）中得到重组质粒pET-E2和pET-GE，转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中，分别诱导表达获

6、得融合有组氨酸标签的重组蛋白E2和GE，随后对重组蛋白表达条件进行优化摸索最佳表达条件，并通过梯度尿素法对重组蛋白进行粗纯化和复性；采用SDS-PAGE和WesternBlotting实验对目的蛋白进行检测，结果显示表达的重组蛋白为能与抗体特异性反应的目的蛋白。最后，为了研究重组蛋白E2、GE在动物体内的免疫原性，将原核表达的重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通过皮下注射免疫小鼠。通过ELISA实验检测免疫鼠血清中猪瘟病毒E2蛋白的抗体水平，结果表明：重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗组均产生较高的

7、抗体水平，但是重组蛋白GE免疫组产生的抗体水平反而低于E2重组蛋白免疫组，由此说明Gp96N基因与E2基因串联经过原核表达后可能减弱重组蛋白的免疫效果，推测Gp96N基因与E2基因串联的位置关系可能会对原核表达的重组蛋白的免疫效果产生影响。关键词：猪瘟病毒E2蛋白Gp96N基因甲病毒载体原核表达免疫原性I中国兽医药品监察所硕士学位论文ABSTRACTABSTRACTClassicalswinefevervirusE2proteinistheenvelopeglycoproteinofclassicalsw

8、inefevervirus,whichcanconferprotectiveimmunity.Ithasbeenthemainobjectiveresearchofthenewvaccine.StudieshaveshownthatGp96Nhasagroovestructurezone,thisregioncanbindtheantigentightlyasthestableGp96-peptidecomplexes.Thu