重组猪瘟病毒e2杆状病毒的构建及其在蚕蛹中表达重组猪瘟e2蛋白

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1、河南农业大学硕士学位论文重组猪瘟病毒E2杆状病毒的构建及其在蚕蛹中表达重组猪瘟E2蛋白姓名：胡刚叶申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：张许科201205河南农业大学2012年硕士毕业论文—摘要摘要猪瘟(CSF)又称古典猪瘟，猪霍乱或欧洲猪瘟，是由猪瘟病毒感染引起的猪的一种高度接触性热性传染病，它主要引起猪的实质器官出血及败血症，猪是唯一的自然宿主，包括驯养猪和野猪，任何年龄、品种、性别的猪和野猪均可发病。它传染性强、致病率高，给世界养猪业造成严重的经济损失，被国际兽疫局(0IE)列为A类疾病。猪瘟病毒

2、为单股正链RNA病毒，有一个大的开发阅读框(ORF)，该开放读码框编码一个大约3898个氨基酸的多聚蛋白。这个多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内裂解成12种病毒特异性蛋白质，其中4种为病毒的结构蛋白，8种为非结构蛋白，EO／Erns，E1，E2是具有免疫性质的3种糖蛋白。Wensvoot等(1990)研究证实，E2蛋白诱导的免疫反应足以保护被免疫猪抵抗CSFv的感染。家蚕养殖在我国是历史悠久的传统产业，发展新兴的生物制药产业是我国新阶段的目标之一，利用家蚕反应器表达CSFVE2蛋白旨在将我国的优势产业与不断发展的

3、分子生物学技术紧密结合起来，不仅为开发高效广谱的猪瘟砸单位疫苗打下基础，同时可以探索利用家蚕生物反应器来表达蛋白节约成本，减少制药的技术难度。本研究旨在通过构建重组猪瘟病毒E2基因的杆状病毒在昆虫细胞和蚕蛹中表达重组猪瘟E2蛋白。根据GenBank登记的猪瘟兔化弱毒株(HMl75885)的序列设计引物，通过RT—PCR方法扩增出CSFv的囊膜糖蛋白E2基因，PCR产物在进行测序鉴定后，其中，引物对EHU／EHD扩增产物命名为PCR．E2，而引物对C6EU／C6ED扩增产物命名为PCR—C6E2，PCR产物通过

4、酶切后连接到供体质粒pFastBacHBM．TOPO和pFastBacl载体上，分别命名为pFastHBM．E2和pFastBac．C6E2。将测序鉴定正确的重组供体质粒pFastHBM．E2雨IpFastBac．C6E2分别转化入DHIOBac感受态细胞中，经过重组培养，筛选发生重组的白色菌落，发生重组的重组杆状病毒质粒命名为Bacmid．E2和Bacmid．C6E2转染入昆虫sf9细胞，获得的重组病毒分别命名为VB∞．E2和VBac．C6E2。利用ELISA、SDS—PAGE和Westemblotting

5、等方法鉴定了两种重组病毒均能够在昆虫细胞中分泌表达。然后，将重组病毒VBae．E2和VBac．C6E2分别注射蚕蛹后，在一定时间内收获蚕蛹血淋巴，经ELISA检测，结果表明两种重组病毒也能够在蚕蛹体内表达重组猪瘟病毒E2蛋白。并根据商品化的试剂盒和猪瘟病毒E2蛋白标准品建立了重组猪瘟E2蛋白定量检测方法，为后续开发诊断试剂盒及亚单位疫苗过程中抗原的定量奠定基础。关键词：CSFV；E2蛋白；重组杆状病毒；分泌表达；蚕蛹；ACNPV7英文摘要CSFVE2recombinantbaculovirusconstruc

6、tionandexpressionofrecombinantE2proteinofCSFinsilkwormchrysalisSupervisor：ZhangXukeMasterCandidate：HuGangyeAbstract：Hogcholeraalsoknownasclassicalswinefever,orEuropeanswinefever,iscomposedofclassicalswinefevervirusinfectioninswineinducedbyahighlycontagiousf

7、ebrileinfectiousdiseases，whichismainlycausedbyporcineparenchymalorganhemorrhageandsepsis，andthepigistheonlynaturalhosts，whichincludingdomesticatedpigsandwildboars，ofanyage，breed，SeXpigsandwildboarsonsetcanbe．Itshighinfectionanddiseaseratethathascausedthepig

8、industryseriouseconomiclossintheworld．ThisdiseaseisclassifiedasAclassdiseasebytheoIE．ClassicalswinefevervirusisasinglepositivestrandRNAvirus，andthereisalargedevelopmentreadingframe(ORF)，theopenreadingf