稳定表达猪瘟病毒e2蛋白细胞系的建立及其生物活性分析

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1、稳定表达猪瘟病毒E2蛋白细胞系的建立及其生物活性分析【摘要】目的:建立一种能稳定表达猪瘟E2蛋白的真核细胞系,并对E2蛋白的生物活性进行分析。方法:从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RTPCR得到了CSFVC株结构蛋白基因E2,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABEpuro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSVG共转染GP2293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK15细胞,嘌

2、呤霉素筛选阳性细胞克隆。通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA方法对表达蛋白的生物活性进行分析。结果:初步检测显示所建立的PK15E2细胞能稳定携带外源基因进行传代,而且表达的E2蛋白能被CSF阳性血清所识别,并具有良好的生物活性。结论:通过该方法建立的真核表达系统是切实可行的,能为猪瘟的预防和诊断奠定良好的基础。【关键词】猪瘟C株E2基因;重组逆转录病毒载体PK15细胞基因表达　　猪瘟(classicalsHI、SalI、HindIII均购自Promega公司;碱性磷酸酶(SAP)和DNA连接试剂盒、大肠杆

3、菌JM109购自大连宝生物有限公司;聚乙二醇(PEG800)购自美国BBI公司;DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海生物工程有限公司;琼脂糖购自美国BioineTM2000转染试剂盒;细胞培养基及优等胎牛血清购自Hyclone公司;猪瘟荧光素FITC标记抗体工作液购自中国兽药监察所;猪瘟病毒抗原检测采用IDEXX公司的ClassicalSHI酶切位点、符合Kozak规则的序列和起始密码子ATG;下游引物中引入了EcoRI位点。该引物由大连宝生物工程有限公司合成。　　1.2.2逆转录病毒载体的构建参照文献［2］,采用

4、RTPCR技术从试验感染兔脾组织中获得了C株E2基因,其中扩增程序为:96℃2min,94℃2min,58℃1min,72℃1min20s,循环35次后,72℃延伸10min。10g/L琼脂糖电泳回收PCR产物。EcoRI,BamHI分别双切PCR产物及载体pBABEpuro,回收目的片段连接、转化,将鉴定为阳性的质粒命名为pBABEpuroE2。　　1.2.3细胞培养方法GP2293细胞培养的条件为37℃,50mL/LCO2,100mL/LFBS的DMEM培养液中,每3d传代1次,中间发现培养液的pH值偏低时,

5、应及时更换培养液;PK15细胞按常规细胞培养方法进行培养。　　1.2.4重组假型病毒的包装以5×105将包装细胞GP2293细胞接种于6孔细胞培养板中。待细胞密度达60%～80%时,在脂质体Lipfection2000的介导下将2μg的pBABEpuroE2与2μg的pVSVG共转染GP2293,转染后8～10h吸出培养液,加入3mL完全培养液培养48～72h,收集包装细胞的培养液,用0.22μm的醋酸纤维素膜过滤(不可以用硝酸纤维素膜过滤,因为硝酸纤维素膜对病毒的膜蛋白具有吸附作用,容易引起病毒的裂解)。滤液

6、-80℃冻存备用。　　1.2.5病毒滴度的检测收集48h培养上清,作1∶100、1∶1000和1∶10000稀释,加入聚凝胺(Polybrene)使其终浓度达8mg/L,接种正常的GP2293细胞,37℃50mL/LCO2培养48h后,更换含嘌呤霉素的选择培养基,10～14d后嘌呤霉素抗性克隆形成。抗性克隆数与病毒液稀释倍数之积即为病毒的滴度。　　1.2.6假型重组逆转录病毒感染PK15细胞选取生长良好的PK15细胞,加入假型病毒上清及Polybrene8mg/L,置37℃,50mL/LCO2孵箱,其间每30min摇

7、1次培养瓶,持续吸附2h。然后离心去除感染液,加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液,37℃50mL/LCO2培养箱中继续培养2d后,加入60mg/L的嘌呤霉素,每3d换1次培养液,持续2周可获得嘌呤霉素抗性的PK15细胞。　　1.2.7E2基因体外表达的检测(1)E2基因的稳定整合鉴定:采用Ugene公司的组织DNA提取试剂盒(TissueDNAKit)提取被感染的PK15细胞DNA(具体方法参考该试剂盒的操作说明进行),用E2基因的特异性引物扩增E2基因,同时设未转染细胞作为阴性对照。所需的扩增模板为不同代

8、次的重组PK15细胞基因组DNA(分别选取第1、10、20、30代)。(2)直接免疫荧光检测E2基因的表达:将盖玻片放入6孔细胞培养板制备飞片,按常规方法培养试验组及对照组细胞。取出细胞飞片,在0.01mol/LpH7.0～7.2PBS中冲洗,干燥,置100g/L丙酮中,4℃固定60min后,室温干燥。于飞片上滴加荧光素标记抗体,