重组e2蛋白在猪瘟检测及免疫方面的应用的研究

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1、摘要接耱疫落娄‘捡溯cs耐免疫抗体瘩平是颈茨与控案l猪瘟煞重娶技术手段。奉磅究逶避藤棱表达系统商效表达了可溶性的CSFvE2蛋白，用亲和层析方法纯化，获得重组E2蛋白抗原。进行了猪瘟的检测及免疫方面的麻用研究：建立了一种检测cSFv抗体的间掇ELIsA方法，研裁了籀辩熬诊叛试潮鑫；穆缝豫魏重缀E2鬣鑫裁维为鞭单蔑分予疫蓖，逶避免疫奉葫搦猿，研究了免疫效果。以上研究为最终成功研制安全、高效、可鉴别的猪瘟亚单位疫苗奠定了基础。1．在犬肠杆菌中袭达可溶性的CsFvE2馐白。应弼R{一PcR窝nPcR扩增了孛酱csF兔纯弱

2、毒(e～椿)鳇￡2基因，{奄建r蒙菝表运载体pG既4T一1，转入到宿主菌BL2l(star)中，在较低的温艘(16℃)和硫代一0一D一、Ii乳糖营(IPTG)浓度(O．1mm01／L)下对重组菡进行了诱导淡达，商效我迭了可溶性的重组E2斌自。结果是示，E2蛋蠢在大晒符甍中褥强了商效表这，可溶性蛋叁静淡达量占融合蛋叁戆40％。2．用岽和层析法纯化重组E2蛋白。GsT融合蛋白与枯胱甘肽的结台是可逆的，期加入还原性答胱甘肽的洗脱液可以高效蛾把结合态G辩融合蛋白洗麓下来。本实验使嗣艟氇gneGsT嚷附型祷耱颥较，通过亲鞫层

3、析方法快速、简易、高敞地从表达随中分离纯化出重组E2蛋白，亲羊u层析纯他后其纯度可达到约85％，其浓度可达5mg／mL，为研究猪瘟诊断试剂盒和掰型程单位分子疫茁奠定了坚实的物质基础。3．蘸立并优住了～静检测esFv抗体的间接ELIsA方法，并研制出褶廊的猪瘟闯攘挠lsA诊断试荆盒。用纯化的重组E2蛋白作为抗原包被酶标极，以辣根谶氧化物酶(HRP)标记的兔抗磴IgG为一二抗，建立了检测猪癜痍毒抗体的闯接ELISA方法，莠确定了ELlSA最佳工作祭搏：抗原包被浓度分捌为8．91Ⅱg，mL；包被条件为37℃放鬣lh厉，再

4、4℃过夜；猪瘟阳性咖清(1：80)在37‘C作用45min，酶标’二抗(1：1000)在37℃作J=

5、；j45mm底物溶液37℃显色15min。通过敏感性实验、特异性试验、鬟整性试骢、对比实验秘稳定性试验，表明：谈方法熬特异性为98．6％。敏感性为95．3％；与国外IDExx公司的同类试剂盒比较，两者的符合率为92％。阁己建立的方法检湖4送检m清样本500份，阳性率为86．4％。4，周蓬组嚣2虽l罢l进行本动物受疫实验。利用大肠杆菌表达的可溶性重组E2蛋舟作为抗原，用弗式饺荆乳化后缀皮下途抒接种40日龄仔猪(猪瘟病

6、毒抗原抗体街为阴性)7头。每次免{!；燕后2l天后采血，利崩夹心ELlSA和正翔阕接囊凝捡潮撼体戆变诧，篱=敬受疫瓣2l天时遴{≥玫毒缳护试验。缝暴袭鞠。第二次热强免疫用抗体水平明显上升；玻毒后对照组4头猪中有三头在3～8天之间全部死亡，篇四头猪在14天时处丁频溉状态，疫苗免疫猪全部存活，无猪瘟病毒感染后的临床症状；无菌采免疫拯猪款瓣橇薅套黪靛，裁箱瓣一P豫方法扩灌E窑蓦爨，结采为戮涟，裁臻l蕊xx公霹es秘抗原检测试剂盒检测猪瘟病毒抗原为阴性。本动物试验结果证明利用大肠杆菌表达的重组E2蛋白能够诱导猪产生中和抗体

7、，并且有确寞的免疫效粜。关键递：藿蕴￡2蛋鑫；猪瘟：G辩；亲窝震辑；蛋鑫鲢纯：阕缕魏lS矗InAbstractVaccinationanddctectionofCSFVantmodympigsisVeryimporta眦．Tbemainantigendom越ns(A，B。CandD)ofE2genec}fcsFVofcs扭瘟1was彝m娜ifiedbyreverse扫湛nsc矗】p￡ion(R11)a聪＆曩cs磷辨l弦雌se馥越狂f。勰。糕殛怒舔ltw嚣辫泌wi￡hpl弱商dpGEM《嚣鑫sy黜继Therccomb

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