bvdv重组e2蛋白间接elisa检测方法的建立及初步应用

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1、摘要牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovineviraldiarrhea/mucosaldisease,BVD/MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrhoeavirus，BVDV）引起的，表现为腹泻、繁殖障碍、免疫抑制、持续性感染和严重的黏膜病等症状。该病主要传染牛，犊牛最为易感，也可感染其他反刍兽和人。与其他瘟病毒属成员有血清交叉反应，给诊断和疫苗免疫带来了极大困难，对我国养牛业产生严重的影响。目前，我国BVDV暂无有效疫苗，因此建立一种快速有效的诊断方法尤为重要。E2蛋白是BVDV的免疫囊膜蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，可以作为BVD诊断蛋白。本研究利用昆虫细胞真核表达系

2、统成功表达E2蛋白并纯化，经间接免疫荧光和Westernblot鉴定，测定蛋白浓度为360μg/mL。以纯化后的E2蛋白为包被抗原，以BVDV标准阴、阳性血清为阴、阳性对照，建立了BVDV抗体间接ELISA检测方法。经过选择和优化，确定蛋白抗原最佳包被浓度为6μg/mL，最佳血清稀释倍数为1：80，最佳包被液选择碳酸盐缓冲液，最佳封闭液选择5%脱脂乳，最佳血清最适作用时间为60min，最佳酶标二抗工作浓度为1：10000，最佳底物作用时间为15min。与国外商品化试剂盒比较，总符合率为91.5%。因此，本文建立的BVDVE2抗体间接ELISA诊断方法可以作为BVDV的检测方法。为了了解黑龙江

3、地区奶牛BVD的流行情况，使用建立的BVDV抗体间接ELISA检测方法，对2012~2014年间黑龙江部分地区1485份奶牛血清进行流行病学调查。结果显示，这3年的BVDV抗体阳性率分别为59.63%、61.70%、70.33%，且三年间的BVDV抗体总阳性率为64.10%，呈逐年上升趋势。统计分析发现，黑龙江地区奶牛BVD流行情况存在西部地区高于东部地区，发病季节无明显差异，规模化养殖场高于散养户的特点。关键词：牛病毒性腹泻病毒；E2蛋白；真核表达；间接ELISA；血清流行病学IAbstractBovineviraldiarrhea/mucosaldisease(BVD/MD)iscaus

4、edbyinfectionofcattlewithbovineviraldiarrheavirus(BVDV).BVDVcancauseDiarrhea,reproductivedisorders,immunesuppression,persistentinfectionandseveremucosaldisease.Thediseasemainlyinfectedcattle,especiallycalves,canalsoinfectotherruminantanimalsandhumenbeings.BVDVhasserologicalcross-reactionswithotherm

5、embersofpestiviruses,itcausedgreatdifficultiesfordiseasediagnosisandvaccine,andhasaseriousimpactonchinesecattleindustry.Atpresent,thereisnovaccineagainstBVDV.Thereforetheestablishmentofafastandeffectivemethodofdiagnosisisparticularlyimportant.BVDVE2proteinisanimmuneenvelopeprotein,asdiagnosticprote

6、in,canstimulatetheproductionofneutralizingantibodies.asBVDdiagnosticprotein.Inthisstudy,theE2proteinwassuccessfullyexpressedandpurifiedbyinsectcellseukaryoticexpressionsystems.Proteinconcentrationwas360μg/mLaftertheidentificationofindirectimmunofluorescenceandWesternblot.Usingtherecombinantandpurif

7、iedE2proteinasantigen,anindirectELISAwassuccessfullydevelopedtodetectantibodytoBVDV.Theoptimalworkingparametersweredeterminedasfollows:therecombinantE2proteinantigenforcoatingat6μg/mL,testingseradilutionat1