锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白基因重组白介素1β的构建及免疫原性的研究

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1、分类号：Q785单位代码：10193密级：公开学号：2012203硕士学位论文锦鲤疱疹病毒囊膜蛋白基因重组白介素1β的构建及免疫原性的研究Constructionandimmunogenicityofinterleukin-1betaofrecombinantkoiherpesvirusenvelopegene作者姓名：高珊学位类别：理学硕士专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：动物病毒分子生物学指导教师：余涛副教授所在学院：生命科学学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容

2、外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印

3、或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要锦鲤疱疹病毒（KHV）又称为鲤科疱疹病毒3（CyHV-3）是一种严重的，致命的，具有高度传染性的病原体，易感染的宿主为鲤鱼和锦鲤。临床和病理症状包括表皮擦伤，产生多余的粘液，鳃和内脏器官的坏死，嗜睡。KHVD主

4、要发生在以色列，印尼，台湾，日本，德国，加拿大和美国的鲤鱼种群，锦鲤疱疹病毒病（KHVD）最近被加入到世界动物卫生署或国际兽疫局必须申报的传染病的名单中，标志着这个病毒感染具有全球性意义。CyHV-3家族被归类于鱼类疱疹病毒科，可以在多个细胞系传播，并且在15〜28℃的温度范围内最为活跃，来自日本（KHV-J），美国（KHV-U）和以色列（KHV-I）三个菌株已被测序。白细胞介素-1（IL-1）是一个关键的早期响应促炎性细胞因子，使生物体应对感染性的非自我感染并诱导导致炎症的级联反应。很多生物学效应可由细胞因子间接介导。IL-1可以作为免疫调节因子增强免疫反应。IL-1主要是在单

5、核细胞中合成，但还通过激活不同来源的巨噬细胞，外周血中性粒细胞，内皮细胞细胞，成纤维细胞，皮肤的郎格罕氏细胞，小胶质细胞和许多其它类型的细胞合成。慢性炎症性疾病中的合成失调以及IL-1家族成员的释放有助于免疫性疾病的发病，如类风湿关节炎，白血病和牛皮癣。已证实IL-1α和IL-1β是IL-1家族的成员。他们在靶细胞上有共同的受体，因此有许多共同的生物效应，但IL-1β在激活体液免疫反应中更有力。本试验以锦鲤疱疹病毒两种囊膜蛋白基因（ORF25基因和ORF81基因）和鲤鱼白介素1β为目标基因，以pIRESneo作为核酸疫苗载体，构建两种真核表达载体，在体外验证重组质粒表达后，对鲤鱼

6、进行免疫。本研究依据Genbank上登录的IL-1β基因序列，设计两对特异性引物，从鲤鱼中提取RNA，经过RT-PCR,PCR和连接pMD18-T，酶切鉴定技术构建pMD18-T-IL-1β-25、pMD18-T-IL-1β-81两种质粒，测序后，序列分析显示，获得了长度为828bp的IL-1β基因，编码275个氨基酸，其相对分子质量理论推导值为30993.24Da，等电点约为5.17。将两段IL-1β目的基因分别与pIRES-neo、ORF25和pIRES-ORF81相连，通过PCR、酶切验证，成功构建了真核重组质粒pIRES-ORF25-IL-1β-25和pIRES-ORF8

7、1-IL-1β-81。大提质粒，转染细胞进行western-blot检测蛋白在细胞中的表达情况，再将重组质粒注射入鱼体内，可分为pIRES-ORF25-IL-1β-25和pIRES-ORF81-IL-1β-81，pIRES-ORF25，pIRES-ORF81，PBS，空质粒，阴性对照15组进行免疫。共免疫3次，在免疫前后分别采血进行ELISA检测抗体水平。ELISA结果说明：肌肉注射重组质粒后在鲤鱼血液中产生锦鲤疱疹病毒特异性抗体，随着时间、剂量的增加，抗体水平也相应增加，但在三