淋球菌外膜蛋白pi基因重组子构建和表达

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1、四川大学硕士论文淋球菌外膜蛋白Pi基因重组子的构建和表达题目淋球菌外膜蛋白p1基因重组子的构建和表达中文摘要目的:扩增淋球菌外膜蛋白PI抗原基因，构建pBS-TPING克隆重组子，测定分析PI序列;构建pET30b-PI-NG重组子，在大肠杆菌中诱导表达淋球菌外膜蛋白PI.为后续PI蛋白免疫学特性的研究、抗体制备、以及预防淋病疫苗的研制奠定基础。方法:本研究分为三部分:第一部分是淋球菌基因组的提取及外膜蛋白PI基因的PCR扩增。提取采集到的四个临床淋球菌菌株细菌基因组，针对其外膜蛋白PorinICPI)基因设计特异性引物，PCR扩增PI基因;第二部分是淋球菌外膜蛋白PI基因的克隆与P

2、I基因的序列分析。将目的基因PI与克隆载体pBS-T在连接酶作用下连接，转化DH5a感受态细胞，抗生素平板、蓝白菌落筛选阳性克隆，质粒抽提，双酶切鉴定，基因测序，与GenBank的相应序列进行序列分析比较;第三部分是淋球菌外膜蛋白PI基因表达质粒重组子的构建与表达。从重组的克隆质粒pBS-T-PI中切取目的基因，插入表达质粒载体pET30b中，转化DH5a感受态细胞，抗生素平板筛选阳性重组子，质粒提取，双酶切和PCR鉴定，选取鉴定正确的阳性重组子转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白质表达，SDS-PAGE初步分析。结果:I.四株临床淋球菌〔分别命名为NG,,NG2

3、,NG3,N吼)的基因组经PCR扩增得到0.9kb-I.Okb范围内的预期长度目的片段，分别命名为PING,,PING2,PING3和PINGao2.将PING=PING2,PING3和PINGa分别插入pBS-T克隆质粒，构建了四川大学硕士论文淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达pBS-TPING=pBS-T-PING2"pBS-TPING3,pBS-TPING4重组子，并分别经EcoRI和kboI双酶切证实和测序。序列分析结果显示，所构建的pBS-TPINGI,pBS-TPING2,pBS-T-PING3和pBS-TPING4重组质粒，在PINGI,PING2,PING3和P

4、ING4片段的插入处的接头完全正确，表明pBS-TPINGI,pBS-T-PING2,pBS-T-PING3和pBS-T-PING4重组质粒构建成功。3.PING,,PING2长度均为907bp，编码302个氨基酸:PING3,PING4长度均为970bp，编码323个氨基酸。4.PINGI,PING2,PING3"PING4的碱基序列、编码氨基酸序列分别与GenBank中相应的淋球菌菌株比较显示:PING:与淋病奈瑟菌菌株4805外膜蛋白I基因(GI:3925497//ACCESSION:AF090819)的碱基有两个位点不同，同源性达99%，编码的氨基酸有一个位点不同，同源性为9

5、9.7%;PING2与淋病奈瑟菌菌株4805外膜蛋白I基因(GI:3925497//ACCESSION:AF090819)有四个位点碱基不同，同源性达99%，编码的氨基酸序列在三个位点处不同，同源性为99%;PING。与淋病奈瑟菌菌株SU106外膜蛋白I基因(GI:1763329//ACCESSION:U75639)有两个位点碱基不同，同源性99%，编码的氨基酸有两个位点不同，同源性99%;PING;与淋病奈瑟菌菌株4174外膜蛋白I基因(GI:3925461//ACCESSION:AF090801)有十八个位点碱基不同，同源性为98%,编码的氨基酸序列有十个位点不同，同源性为97.

6、5%。四个PING碱基序列之间比较，有二百三十二个位点不同，同源性为74%;编码的氨基酸序列有一百个位点处不同，同源性为67%。进一步比较发现，PING，与PING2的碱基在两个位点处不同，同源性高达99.8%，编码的氨基酸在两个位点处不同，同源性高达99%;PING3与PINGa在二十个位点处碱基不同，同源性为98%，编码的氨基酸在十三个位点处不同，同源性96%.PINGi,PINGZ与PING3,PINGa可能分别属于PI的两种亚型PIA和PIBo5.将PINGi,PINGZ,PING3和PING;分别插入pET30b，构建了pET30b-PING=pET30b-PINGZ,pE

7、T30b-PING3,pET30b-PING4重组子，并分别经EcoRI四川大学硕士论文淋球菌外膜蛋白PI基因重组子的构建和表达和XhoI双酶切和PCR证实。6.将pET30b-PINGI,pET30b-PING2,pET30b-PING3,pET30b-PING4重组质粒分别转化表达型宿主BL21(DE3)，用IPTG在大肠杆菌中诱导表达淋球菌外膜蛋白PI,SDS-PAGE结果初步显示，pET30b-PINGI,pET30b-PING3,pET306-P