肺炎衣原体ompa基因vd2-vd3区重组蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

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1、主要缩略语英文索引缩略词全称中文名称AA/aaaminoacid氨基酸A450absorbanceat450nm450nm处吸光度BCAbicinchoninicacid二辛可宁酸bpbasepair碱基对BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CpnChlamydiapneumoniae肺炎衣原体DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPsdeoxynucleosidetriphosphates脱氧核苷三磷酸DTTdithiothreitol二硫苏糖醇EBethi

2、diumbromide溴化乙锭ECLenhancedchemiluminescence增强化学发光EDTAethylenediaminetetraceticacid乙二胺四乙酸ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验Hishistidine组氨酸6×His6histidinedomain6个组氨酸残基HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IPTGisopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KD

3、/kDaKilodalton千道尔顿mAbmonoclonalantibody单克隆抗体MOMPmajoroutermembraneprotein主要外膜蛋白Ni-NTAnickelnitrilotriaceticacid镍-亚硝胺乙酸OmpAoutermembraneproteinA外膜蛋白APBSphosophate-bufferedsaline磷酸缓冲盐溶液1PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应rpmrevolutionsperminute每分钟转数SDSsodiumd

4、odecylsulfate十二烷基硫酸钠SDS-PAGESDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳TBSTris-bufferedsalineTris缓冲盐溶液TETris/EDTA(buffer)Tris/EDTA缓冲液TEMEDN,N,N´,N´-tetramethylethylenediamineN,N,N´,N´-四甲基乙二胺TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷X-gal5-bromo-

5、4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷2肺炎衣原体OmpA基因VD2-VD3区重组蛋白的表达、纯化及免疫活性研究硕士研究生：周洲导师：吴移谋教授中文摘要目的：构建含肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白（MOMP）优势表位（147~297aa）基因的重组表达体，在大肠杆菌BL21中进行诱导表达，纯化表达产物并进行免疫原性和抗原性分析，为探索重组蛋白在肺炎衣原体血清学诊断中的应用奠定前期实验基础。方法

6、：通过生物信息学分析，筛选OmpA（MOMP的编码基因）优势抗原表位的编码基因，以CpnAR-39标准株DNA基因组为模板，Taq聚合酶链反应扩增目的片段，将此片段克隆于pUCm-T载体，经酶切和PCR鉴定后，目的片段亚克隆于原核表达载体pET30a中，构建重组体pET30a-MOMPVD2-VD3，然后转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3)，经酶切、PCR和测序筛选阳性克隆，挑取单个含重组质粒pET30a-MOMPVD2-VD3的工程菌阳性克隆进行培养和IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和

7、Western-Blot进行分析和鉴定表达产物；Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，并进行稀释透析复性，BCA法测定纯化蛋白浓度。用纯化复性的MOMPVD2-VD3重组蛋白免疫BALB/c小鼠，间接ELISA方法检测免疫鼠血清中MOMPVD2-VD3多克隆抗体的效价，对MOMPVD2-VD3重组蛋白的免疫原性进行分析；并以纯化的MOMPVD2-VD3重组蛋白包被微孔板，建立间接ELISA方法，检测Cpn参比血清和临床冠心病患者血清，同时与晶美公司CpnIgGELISA诊断试剂盒检测结果进行比较，根据间接

8、ELISA检测效果，评价重组抗原在Cpn血清学诊断中的应用价值。结果：软件分析OmpA的抗原表位编码基因并选择了OmpA的442～873bp位碱基序列为目的基因（片段长度为432bp，编码144个氨基酸），PCR扩增3得到以大小约为450bp的目的片段；构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明其中插入片段为OmpAVD2-VD3目的基因，测序结果与Genbank上登录序列完全一致；SDS-PAGE分析显示，在IPTG诱导下，重组工程菌表达了一