猪细小病毒2型间接elisa与间接免疫荧光检测方法的建立及血清流行病学初步调查

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分类号：1密级：S8洳专：j、噎单位代码：!Q兰量§．学号：21Q12Q互!硕士学位论文⑧中文论文题目：猹细型∑痘耋2型闻接型S△皇闻接鱼瘗夔选捡测友洼笪建童区鱼渲逋红痘堂垫垄遢查英文论文题目：—TheEstablis—hmentandEpidemioloeical，InvestigationofPorcineParvovirus钾oe．1．．．．．．．．．．．．．．．．．．2BasedoniELISAandIFA申请人姓名：羞翅蛊。指导教师：金担垩副夔援学科(专业)：亟随盖匡堂所在学院：动物型堂堂院论文提交日期垄Q呈至生量目l 浙江大学硕士学位论文一I嗍删⑧论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：孙妒·答辩委员会主席：立目錾丝：蕴筮．委员1：盘丝丞遣委员2：垒兰业物丞篮。：委员3：蛰二j兰釜盔篮；委员4：互：二鎏圣径坠：委员5-——答辩日期：上吐乏弘碍fn 浙江大学硕士学位论文TheEstablishmentandEpidemiol02icalInvestieationofPtPrvovirustype2Based0一’’“1andIFAPorcineIt"aniELISAan1ArV00■■■■■■■■■■■●■●■■■■■■■■■■■■■■●■■■■■■■■■■■■■■■■■■■●■■■■一I■_____■■■■■■■■■■■■●■●●■■●■■■■■■■■■●■■■■■■■■■■●■■■■■■■●■■■■●■■■■●■■■■■■■■■■■■■■■■●⑧Author’ssignature：一‘●‘Supervisor7Ssignature：ExternalReviewers：ExaminingCommitteeChairperson：ExaminingCommitteeMembers：Dateoforaldefense：3 浙江大学硕士学位论文浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝堑太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：飘签字日期：pI≥年以月f蜘学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝堑太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：i髟彳pv导师签名：签字日期勘、V年口b月、归签字日期：日4 浙江大学硕士学位论文课题来源：自选课题5 浙江大学硕士学位论文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．：!缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4第一部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51猪细小病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．1分类与地位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2PPV生化特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．3PPV分子生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．3．1PPV基因组的转录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．3．2PPV基因组编码蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．3．2．1结构蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．3．2．2非结构蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．4PPV的检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81．4．1分子生物学检测方法⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．4．1．1PCR检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．4．1．2环介导等温技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．4．1．3核酸探针检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4．2血清学检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．4．2．1间接免疫荧光技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．4．2．2酶联免疫吸附试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．4．2．3血清中和试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．4．2．4银加强胶体金技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．4．3病毒学检查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112PPV2研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．1PPv2的分子生物学特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯113PPV3及PPV4研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第二部分研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第一章PPV2间接ELISA方法的复核⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．131．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．1菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．141．2培养基和抗生素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．3蛋白提取，纯化复性相关试剂和溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．3．1包涵体纯化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．3．2镍柱纯化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．151．3．3复性缓冲液⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．3．4SDS-PAGE相关试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．3．5Bradford法相关试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．171．4血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．171．5ELISA溶液和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．171．6仪器及材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．182．1猪细小病毒2型VP2蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．1．1表达条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．186 浙江大学硕士学位论文2．1．2重组蛋白大量诱导表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．1．3重组蛋白包涵体的洗涤与纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．1．4蛋白复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．1．5SDS—PAGE电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202．1．6蛋白浓度测定与保存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．2猪细小病毒2型间接ELISA方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．2．1反应板均一性的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．2．2抗原包被浓度和血清稀释浓度的测定(棋盘滴定法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．2．3封闭液的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．2．4血清最适作用时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．2．5酶标二抗孵育时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．2．6最佳显色时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2．7建立间接ELISA的阴阳性判断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．2．8阻断性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．2．9重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．2．9．1批内重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2．9．2批间重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2．10敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．232．2．11酶标板保存时期试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1蛋白最佳表达条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．233．2PPv2、『P2蛋白的纯化和复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．243．3PPV2VP2的浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．4酶标板均一性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．5抗原最佳包被浓度以及血清稀释倍数的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．6最佳封闭液的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．263．7血清最适作用时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．8最佳显色时间⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．9阴阳性临界值的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．10阻断试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．11重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．12．1批内重复⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．12．2批间重复⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．12敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．283．13酶标板保存时期试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29第二章PPV2间接免疫荧光方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．1细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．321．2血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．321．2．1PCR阳性血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．321．2．2阴性血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯321．3试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．322．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．327 浙江大学硕士学位论文2．1细胞系的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．2接毒后蛋白表达时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．3固定液和固定时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．4血清的最佳稀释倍数确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．5一抗最佳作用时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯332．6二抗的最佳稀释倍数确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．7二抗最佳作用时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．8间接免疫荧光结果的判定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．9特异性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．9．1细胞培养板的自发荧光对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．9．2空白对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．i0IFA敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．IiIFA重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．1细胞系的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．2蛋白表达时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．3固定液以及固定时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．4一抗、二抗最佳稀释倍数及作用时间的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．5间接免疫荧光最佳作用程序及结果判定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．363．6IFA特异性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．6．1自发荧光性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．6．2空白对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．7IFA敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．8IFA重复性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．384．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38第三章使用间接ELISA方法和间接免疫荧光方法进行血清流行病学的初步调查⋯⋯⋯．401．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯401．1．血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．401．1．1．阳性血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．，．⋯⋯⋯⋯⋯401．1．2．阴性血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l1．1．3．待检血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯411．2．试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯411．3．试验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯412．1．间接ELISA试验对待检血清检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4l2．1．1．包被⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．1．2．洗涤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．1．3．封闭⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．1．4．一抗孵育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．1．5．二抗孵育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．422．1．6．显色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．422．1．7．终止⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．422．1．8．读数与判断⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．422．2．间接免疫荧光对待检血清检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．428 浙江大学硕士学位论文2．2．1．抗原板的制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．422．2．2．固定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．432．2．3．孵育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．432．2．4．镜检⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．433．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．47本研究创新点及后续研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53附录一实验仪器及设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54附录二攻读硕士期间参与的课题与发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．569 浙江大学硕士学位论文姜轲冉摘要猪细小病毒病是由猪细小病毒(porcineparvovirus，PPⅥ引起的在母猪特别是初产母猪中不孕、流产，死胎、木乃伊胎等繁殖障碍综合性疾病。该病在全球范围内广泛存在，间接或直接造成了养猪业重大的经济损失。近年来，研究发现PPV出现了很多新的变异株。其中，猪细小病毒2型(Porcineparvovirus，PPV2)是2001年在缅甸猪戊型肝炎(HEv)研究过程中新发现的细小病毒科的成员，与传统的猪细小病毒(猪细小病毒1型)亲缘性较远。迄今为止，只在缅甸和中国有相关报道。我们在进行浙江省爆发的猪高热病相关研究中，分离到了PPV2，针对该病毒进行了一系列的研究。为了加强对该病的疫情监测和血清流行病学调查，有必要研发出一种在特异性和敏感性均较高的血清学检测方法。本研究利用大肠杆菌表达系统表达了PPV2VP2蛋白，在本实验室孙宗英的基础上探索性复核了间接ELISA检测方法：将构建好的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，而后通过提取包涵体，His亲和层析法纯化，透析法复性。将该重组蛋白作为抗原包被酶标板，以PCR阳性混合血清作为阳性血清及某猪场未吃初乳的新生仔猪阴性血清作为一抗血清，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG作为二抗，建立了针对PPV2VP2抗体的间接ELISA。在方法复核过程中，对该间接ELISA各种反应条件进行调整，确定了最适工作条件。最后，重复性试验(批内，批间)，敏感性试验结果表明，该方法是可靠的。同时利用本实验室徐雅萍建立的PPV2．ORF2重组腺病毒，对PPV2ORF2进行了真核表达，建立了针对PPV2ORF2间接免疫荧光检测方法。在试验过程中，对IFA使用的细胞系，接毒时间，固定液及固定时间，一抗反应浓度及反应时间，二抗FITC反应浓度及反应时间进行了摸索，最后对建立好的方法的特异性，敏感性及重复性进行了测定。实验结果证明，该检测方法可靠。使用建立好的间接ELISA和间接免疫荧光方法对采集自华东地区的357份猪血清进行检测，结果发现间接ELISA方法检测得到138份阳性血清，间接免疫荧光检测得到130份阳性血清，在12个不同猪场血清中除部分血清外，其阳性复合率较好。两种方法对辅助监测PPV2抗体水平以及掌握流行病学规律有着较大意义。关键词：猪细小病毒2型；间接ELISA；间接免疫荧光 浙江大学硕士学位论文姜轲冉AbstractPorcineparvovims(PVⅥoausesreproductivefailurecharacterizedbyemb巧omcandfetalinfectionanddeath，sometimesintheabsencoofoutwardmaternalclinicalsigns．Thevirusisubiquitousamongswinethroughouttheworld．Porcineparvovirustype2(PPV2)，wasanewlydiscoveredmemberofthefamilyparvovirdea．However,PPv2formedadistinctclusterwithporcineparvovims．Toinvestigateandcontrolthisdisease，ahighspecificityandsensitivityofserologicald慨tionmeI【hodsshouldbedevelopedimmensely．Inthefirstpartofthisresearch,arecombinantplasmidpET28a-VP2wastransferredintoE．coliBL21(DE3)；afterextractedandpurifiedtheprotein，theantigenWasobtainedforindir∞'tELISA．ThenthereactionconditionswereoptimizedandStrategyofindirectELISAWasdeveloped,including2．0I-tg／mlcoatingantigen,1：25dilutionoftestingserumand1：1000dilutionofHRPconjugatedanti-swine埯GReactionofcoatingtestingserumandHRPantibodyWasoptimizedas1hourat37"C，andOPDHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentSolutioncost15raininroomtemperature．AfterdetectingtheODvalueof10negativesera,comprehensivepositivestandardfortheELISAwasdeterminedas0．354．SensitivityandrepeatabilityofthismethodWastestedwell．Meanwhile，PPV2ORF2WasexpressedinHEK293AviatheadenovirusvectorwhichconstructedbyYapingXuandthestrategyofindirectimmunofluoresconcoWasdeveloped．Inthisprocess，thereactionconditionswereoptimizedandspecificity,sensitivityandrepeatabilityWastestedwhichshownthatitWasareliablemethod．Inthelastpartofthisresearch，twomethodswerecomparedbytheresultofSerologicaldiagnosis：357semofswineweretestedbythemethodsabove；andAnalysisofBiostatisticsexhibitedthehighoverlapswhichcouldapplytomonitorthediseasewell．Onehundredthirtyeightoutof357Sel"awerepositiveforPPVbyⅡ’Awhile130outof357serawerepositiveforPPVbyindirect-ELISA．Exceptedfora2 浙江大学硕士学位论文姜轲冉fewc,aso，thecompoundrateofpositiveserawasabout75％．ThecombinationoftwomethodswillreducethefalserateandraisetheefficiencyofEpidcmiologicalInvestigation．Keywords：PPV2；indirectELISA；indirectimmunofluorescence3 浙江大学硕士学位论文姜轲冉OPDbpBSACVDM匝MEDTAEUSAFCSHRPh培G口TGODPAGEPBSPCRPPV2SDS缩略词表1，2-diaminobenzeneBasepairBovinesenlmalbuminCoefficientofvariationDulbecz,o’SmodifiedeaglemediumEthylenediaminetetraaceticacidEnzymelinkedimmunosorbentassayFetalcalfserumHorseradishperoxidaseHourImmunog]【obulinGIsoproplyl-B··D·-thiogalactosideKanamycinKilodaltonN’，N’，N’，N’-tetra]methylethylenediamineOpdCaldensePolyaerylamidegeleleetrophoresisPhosphatebufferedsalinePolymerasechainreactionPorcineparvovirus2Sodiumdodecylsulfate邻苯二胺碱基对牛血清白蛋白变异系数DMEM培养基乙二胺四乙酸酶联免疫吸附剂试验胎牛血清辣根过氧化物酶小时免疫球蛋白异丙基．B．D．硫代吡喃半乳糖苷卡那抗生素千道尔顿N，N，N’，N’一四甲基乙二胺光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应猪细小病毒十二烷硫酸钠4DR膏U{寻D卧酣如一 浙江大学硕士学位论文姜轲冉第一部分文献综述猪细小病毒(PorcineParvovirus，PPⅥ是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。其特征是在孕前期受到感染时，经胎盘使胚胎或胎儿受到感染，引起母猪流产、死胎、畸形胎、木乃伊胎及不孕等，同时还可能引起仔猪的皮炎和腹泻。各种不同类型的猪包括：家猪、野猪、仔猪、后备猪、育肥猪以及SPF猪均可感染PPV，但除怀孕母猪外，其他均无明显临床症状(Cam喇g虬S．Fota．1．1967)(Mcngeling1978；Mengeling，Lagereta1．1991)。1966年Mayr等首次分离到该病毒同时证实了其病原作用mahnd，Mayrota1．1966)。此后在欧洲、美洲、亚洲、非洲及大洋洲很多国家均有相关报道。1982年由中国兽医药品监察所分离到该病毒，先后在上海、黑龙江、吉林、四川、浙江、陕西等地分离到该病毒(潘雪珠eta1．1983)(贾赞，芦银华eta1．2004)。PPV对养猪业危害非常大，在我国经产母猪及种公猪感染率极高。因此，随养猪业的发展，大型猪场的相继出现，该病呈上升趋势，并给该行业带来极大的经济损失(刘业兵，王晶钰cta1．2007；Zhang,Songcta1．2010)。1猪细小病毒1．1分类与地位猪细小病毒属于细小病毒科(Parvovirdae)、细小病毒亚科@aⅣ0池)、细小病毒属(Parvovims)(Bachmann1972；Siegl1976)。细小病毒属是目前动物病毒中最小最简单的一类单股负链DNA病毒；除此之外，还有牛细小病毒(Bovmeparvovinls，BPV)、犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)，水貂肠炎病毒(Minkenteritisvirus，MEV)、猫泛白细胞减少病毒(Felinepanleukopcniavirus,FPV)、绵羊细小病毒(Sheepparvovirus，SPⅥ、阿留申病毒(Aleutiandiseasevirus—ADV)、等(Cotmore，Sturzcnbcckercta1．1983；Mengeling，Paulota1．1986；Mengeling，Ridpathcta1．1988)。1．2PPV生化特性PPV是Mayr和Mahnd等于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的(Malmel，Mayreta1．1966)，起初被认为是细胞内潜伏感染的病毒，而后相继从一些正常的猪肾细胞中发现直径为22～23nm的DNA病毒。Lewis等(Lewis，Leeeta1．1967)于 浙江大学硕士学位论文姜轲冉1967年从流产胎儿中分离出PPV，首次证明了其致病作用。而后，通过血清学鉴定证实，上述病毒和类似病毒均与PPV同属一型。PPV无囊膜，直径约18～26nm，成熟的病毒粒子为二十面体等轴立体对称，有2～3个衣壳蛋白(分子量为60KD)，含有约5000个核苷酸，DNA的浮力密度为1．729／ml。美国的Molitor等的研究表明PPV病毒粒子，分别为实心和空心两种，二者在CsCl中的浮力密度为1．399／ml和1．309／ml，且都具有PPV血凝活性(Molitor,Jooeta1．1983)。PPV是自主复制性病毒，成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组，两端均有发夹结构，该结构对其复制是非常重要的。PPV基因编码三种结构蛋白即VPl，VP2，VP3，VPl蛋白并非为衣壳装配必需，N端含有碱性残基，细胞核内定为至关重要；VP2为病毒粒子的主要内容，约占80％，它是主要的免疫原性蛋白，决定病毒的血凝活性和组织嗜性；VP3是VP2水解产生，只在衣壳装配和病毒基因组包装后出现似饥gel吨1972)：故诱导抗体的能力以VP3最强，VPl和VP2次之。PPV基因编码的三种非结构蛋白为NSl，NS2和NS3，其中NSl蛋白在调节PPVDNA复制是起作用，NS2和NS3的功能目前尚不清楚(Cartwrigh：t’Luoaseta1．1969)。PPV可以凝集豚鼠、大鼠、人、猴、小白鼠、鸡和猫的红细胞，不能凝集牛、绵羊、仓鼠和猪的红细胞。其中以豚鼠红细跑最好，鸡红细胞对本病的敏感性有很大的个体差异。红细胞来源的动物年龄以及血清中非特异性凝集素和抑制素是否处理都是影响血凝和血凝抑制试验的主要因素0Aallauer,Sie西eta1．1972；BaohmannandDanner1976)。迄今为止，猪细小病毒只能在来源于猪的细胞(如原代猪肾细胞、猪睾丸细胞、猪睾丸细胞及PK-15、CPK、IBRS．2、MVPK、ST等传代细胞)和人的某些传代细胞(如Hda、Hep．2等细胞)中培养增殖，其中以原代猪肾细胞较为常用(Mayr,Bachmanneta1．1968；Bachmann1972)。1．3PPV分子生物学特性PPV作为细小病毒科细小病毒属的成员之一，有着自主复制性的特点。在其3’端和5’端有两段折叠配对序列，在3’端的102lit序列中，有Y形发夹结构，而5’端的127nt为U形结构。PPVDNA完全依赖于宿主DNA的复制进行复制自身，且几乎只能在细胞周期的S期的晚期和G2期的早期进行。由于PPVDNA6 浙江大学硕士学位论文姜轲冉的发夹结构产生了DNA多聚酶作用所需的引物．OH，故其复制不需要DNA环化和RNA引物，在宿主DNA多聚酶的作用下，自病毒基因组端发夹结构的3-OH起始合成互补链，将亲代DNA转变为双链复制型DNA，再以RFDNA为模板，合成病毒mRNAs和子代病毒基因组。病毒基因组有两个主要的ORF，分为3’端编码结构蛋fl(vP)，5’端编码非结构蛋白(NS)，即调节蛋白。整个编码区基因相互重叠，但结构蛋白和非结构蛋白有各自独立的启动子区域。1．3．1PPV基因组的转录PPV感染宿主细胞后，早期启动子P4和晚期启动子P40分别自基因组225nt和2035nt处转录，产生PT4和PT40，共同终止于4833nt处的Poly(A)。经过四种不同剪接方式，产生四种次级转录产物：R1(4．7Kb)，R2(3．3Kb)，R3和R4(2．9Kb)。PT4不经过拼接，即R1，编码663个氨基酸的非结构蛋白NSl，分子量约为75．5KD，小于SDS-PAGE估计的分子量(-84I(D)，这可能是因为后者为磷酸化的产物(Vasudevacharya,Basaketa1．1989)。R2是PT4的C型拼接产物，编码106aa的非结构蛋白NS2，其N端有86aa与NSl的完全相同。C末端的75aa为NS2特异性的。R3为PT4的剪接产物，编码106aa的非结构蛋白NS3，而与NS2一样，其N端有86aa与NSl完全相同，C端的20aa与NSl的不同，而与VPl编码区重叠，而目前尚无证据证明PPV感染的细胞中有NS3蛋白存在(KennethandGortner1984)。在PT40中有2个剪接供体位点和一个剪接受体位点，PT40经过B型剪接产生约2．9Kb的VPlmRNA，经过A型剪接产生约2．9Kb的VP2mRNA；VPlmRNA和VP2mRNA分别从2287nt和2810nt处的ATG起始翻译，共同终止于4547nt处的TAG，产生两种结构蛋白VPl(80．9KD)和VP2(64．3KD)，它们的分子量与Molitor等通过SDS．PAGE估计的84KD和64KD相近(Molitor,Joocta1．1984)。因此，普遍认为VP3是VP2的翻译后切割加工的产物。1．3．2PPV基因组编码蛋白1．3．2．1结构蛋白PPV基因组编码三种结构蛋白，为衣壳蛋白：VPl，VP2和VP3，它们的分7 浙江大学硕士学位论文姜轲冉子量分别为83KD、64KD和60KD(Molitor,Jooeta1．1983)。VPl蛋白C端氨基酸与VP2的N端氨基酸序列相互重叠。PPVVPl蛋白与鼠类细小病毒MVM．H．1，犬细小病毒(CPV)和猫细小病毒(FPⅥ的VPl蛋白有较高的同源性，其N端富含碱性残基，其中存在类似SV40和多瘤病毒VPl蛋白N端的核内定位信号序列NLS，即MAPPAKRAKR。这种序列信号特征对于所有细小病毒在细胞核内的定位是非常重要的，类似与SV40的T抗原，可介导其自身或异种蛋白进入细胞核。ClanKC等(Chcng，Smithcta1．1986)对细小病毒衣壳蛋白的ORFs进行了比较分析，发现其中有所有细小病毒所共有的一些保守序列，如NPYL，TPW和PIW；而另一些保守序列为自主性细小病毒所共有，如GGG，PGY，YNN。PPVVP2蛋白与MVM，CPV和FPV有较高的同源性，其中含有P1W序列，在无感染性的缺损病毒NADL-2’的基因组中却没有相应序列，故我们推测这段保守序列可能是产生完整的病毒结构蛋白以及成熟的病毒粒子必不可少。在PPVVPl蛋白的近N端有连续的9个甘氨酸，这种GGG样的甘氨酸富集区折叠形成螺旋结构，分析可能是产生VP3蛋白的切割位点。1．3．2．2非结构蛋白PPV基因组编码三种非结构蛋NSl(75．5KD)、NS2(18．1KD)和NS3(12．4KD)。PPVNSl蛋白与MVM、CPV的NSl蛋白有较高的同源性；同时其中也含有所有细小病毒共有的保守序列GKRN；目前认为该序列与ATPase或GTPase相关的结合位点，同时具有解螺旋活性，它与病毒DNA末端的空间构型相关，对病毒DNA的复制是必需的(yam，Mancluscta1．1989)。细小病毒DNA复制是依赖其末端发夹结构，其起始和终止病毒DNA复制过程的先决条件是从特异位点解开，以使3’端区的序列来引导DNA合成。因此NSI蛋白具有调节PPVDNA复制的作用。而NS2和NS3蛋白的功能目前尚不清楚。1．4PPV的检测方法猪细小病毒的诊断方法很多，国内外已经建立的传统的血清学诊断技术有：血凝和血凝抑制试验(HA和HD(DarbyshireandRoberts1968；Paul，Mengelingeta1．1982)、胶体金法、对流免疫电泳技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)和单克隆抗体技术等。随着分子生物学的高速发展，近年来PPV分子诊断技术也得到了很大发展，包括建立了PCR检测技术、核酸探针技术等检测方法(Tummamkand8 浙江大学硕士学位论文姜轲冉Tanfilertcharoen2011)。1．4．1分子生物学检测方法1．4．1．1PCR检测技术PCR技术是指设计特异性的引物在体外扩增特异DNA片段，与电泳技术相结合的方法，其特异性强，敏感性高。刘俊辉等以PPV的VP2基因作为模板设计了一对引物，成功地从PPV兔传代的组织及其细胞培养物中扩增出了312bp的特异性片段。敏感性试验表明，PCR扩增可以检测出IO-4TCID50的病毒含量(刘俊辉，龚振华eta1．’2004)。Miao等M1建立了SYBRGreen实时PCR检测方法，用于检测PPV感染及其在感染猪体组织内的含量与分布情况。Miao(Miao，Zhangeta1．2009)等利用SYBRGreen建立实时PCR反应检测猪细小病毒定量(PPV)的方法，该方法的可检出0．001TCD50恤1。同时，针对混合感染的趋势越发严重，相继有学者建立针对多种病毒的多重PCR。2012年Perez，L．J．等利用SYBRGreenI的，同时区别检测的猪圆环病毒2型(PC、L2)，猪细小病毒(PPV)，伪狂犬病病毒(PRV)，TSuVl和TTSuV2，其检测出3．65x103～5．04x1030'erez，DiazdeArceeta1．2012)。Ogawa(Ogawa,Tairaota1．2009)．等多重PCR及多重RT-PCR来检测猪圆环病毒2型(PCV2)，猪疱疹病毒1型，猪细小病毒(PPV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PI汛SV)，日本脑炎病毒，猪轮状病毒一个(PoR：VrA)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，Gctah病毒9个病毒。可见PCR是一种灵敏性高的检测手段，但无法区分自然感染与疫苗感染株。1．4．1．2环介导等温技术环介导等温扩增技术(100p-mediatodisothermalamplification，LAMP)是一种新兴的核酸扩增技术，有着高特异性、高敏感性、快速、简便等优点(Vigouroux，Furukawaeta1．2003；张跃伟，李旭妮eta1．2010)。吴文学等针对猪细小病毒NS．1基因设计引物，建立了猪细小病毒LAMP检测方法(吴文学2011)。使得LAMP方法在临床检验上具有广阔的应用前景，为早期诊断、防制和净化提供了一种新方法。1．4．1．3核酸探针检测技术核酸探针技术可以定性或定量检测特异RNA或DNA。目前广泛应用的是地Q 浙江大学硕士学位论文姜轲冉高辛标记(DIG)的核酸探针，具有高度的特异性、敏感性，已用于各种常见病毒病的诊断、基因杂交等。Krcll等首先将核酸探针技术应用于PPV的诊断，用放射性将克隆片段转迸大肠杆菌TBl，而后以同位素32P标记，作为斑点杂交的探针，该方法的敏感性是血凝试验的100倍(Krell，Salaseta1．1988)。随后，Waldvogcl等以原位杂交试验与免疫电镜试验相比较，使用53个有免疫反应的胎儿组织和免疫荧光试验比较敏感性和实用性。通过ⅢM试验，15个胎儿中有11个为阳性，4故为阴性；心肺组织更适于原位杂交，其中IEM的n个阳性在ISH中表现8个阳性，血清学检测为阳性的38个，ISH可检出33个。结果显示，ISH的敏感性低于IEM，但可以检测无免疫活性的感染胎)1．(Waldvogel，Brollota1．1995)。1．4．2血清学检测方法1．4．2．1间接免疫荧光技术免疫荧光方法在研究PPV中被广泛使用(Cartwright,Lucaseta1．1969；MengelingandCutlip1975)。董齐等建立免疫荧光直接法检测组织病料中的PPV抗原，将猪细小病毒高免血清与胎儿组织中PPV抗原形成特异的反应，发现该方法敏感快速(董齐，韩孝成eta1．1999)。梅淼等利用间接免疫荧光研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性(梅淼，陈燕凌eta1．2012)。1．4．2．2酶联免疫吸附试验Westeabrink,F．等最早建立了基于双抗体夹心法的原则的基础上的竞争酶联免疫吸附试验检测猪细小病毒(PPV)(Westenbdnk,Veldhuiseta1．1989)。Qing(Qing，Lveta1．2006)．等基于非结构蛋白(NSl)建立了酶联免疫吸附试验，OD0．23是临界值，该方法的特异性高100％，灵敏度为88％，准确性(90％)，重复性试验血清的变异系数均小于10％(Hohdatsu，Babaeta1．1988)。1．4．2．3血清中和试验血清中和试验原理是动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力(JohnsonandCollings1971)。JooHS等首先使用血清中和试验检测PPV抗体000，Donaldson-Woodcta1．1975)。10 浙江大学硕士学位论文姜轲冉1．4．2．4银加强胶体金技术银加强胶体金技术(Silver-enhancedcolloidalgoldassay,SECGA)是近年来的一种新技术(Driskell，Kwartaeta1．2006)，黄瑜等(黄瑜，甘孟侯，刘尚高1995)曾浃证明该方法对纯化的PPV抗原最低检出量为0．3125ng／点，劳具有经济誊i敏感性、特异性强等优点，可用萋：PPV：感染的转舞诊断。为胶捧金技术应用予畜禽转染病的诊断和研究奠定基础。其敏感性分别为间接DotELISA和HI的8倍和1000倍。它与检测PPV抗原的荧光抗体技术、ELISA等相比较，试剂和样本用量少，无需荧光显微镜、酶标仪，避免了同位素的放射性污染和酶底物的致癌性作用；但如操作上会可能影响结果的准确性，试验所用的试剂需用去离子水配置及试验结果受主观因素影响等。1．4．3病毒学检查采集疑似的流产和死胎的组织(Bachmann,Sheffyeta1．1975；CutlipandMengeling1975；Mengeling1975)：包括肾、肺、肝、脑、睾丸和胎盘等，其中以肝脏作为病料分离率较高。病毒分离可将病料研磨为悬液，离心，取上清接种于原代猪肾细胞。根据病料中的浓度，接种后可于24h一72h出现细胞病变。超过70日龄的死胎、木乃伊胎和新生仔猪不易检出，因为这些胎儿已有完整的免疫反应，感染了PPV会产生抗体，影响病毒的分离。病毒分离鉴定是基本的检测方法。2PPV2研究概况2．1PPV2的分子生物学特点近年来，不断有很多新的猪细小病毒毒株被报道，但是有趣的是，它们之间的亲缘性存在较大差异。2001年，I-Iijikata等在研究来自缅甸的猪血清中鉴定戊型肝炎时，发现了1株基因组大小为5118bp，含有两个ORF的病毒(Hijikata,Abeeta1．2001；Csagola,Lorinezeta1．2012)。其中ORFl中含有细小病毒共同的保守区，因而起初将其归入到了PPV。2006年本实验室竺春，建立了从猪血清中检测未知病毒的方法，并从浙江地区猪场采集的血清中扩增到三条500bp左右的序列，通过BlastN分析，与Hijikata在缅甸分离到的PPV有高达90％以上的同源性；其后本实验室黄贤波获得了全长序列获得了3株PPV变异株(YHl4、JHl3、 浙江大学硕士学位论文姜轲冉YW8)的全长序列，其基因组大小为5119bp，经鉴定均被归为猪细小病毒II型，即PPV2。3PPV3及PPV4研究概况2008年Lau等报道Porcinehokovirus(猪细小病毒Ⅲ型，即PPV3)和Bovinehokovirus(BHoV)(LaIl'Wooeta1．2008)。2009年，Cheung等在与猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的患病猪肺泡灌洗液中鉴定出1株新型的猪细小病毒，命名为猪细小病毒4型，即PPV4，该病毒与牛细小病毒2型同源性最高，约21．3％(Cheung2009)。PPV4基因组全长约5905bp，预测含有3个ORF，与编码ORF3牛犬细小病毒属(如牛细小病毒、犬细小病毒和booavirus等)的同源性较高。PPV4的ORF3编码一个含204个氨基酸残基的蛋白质，与bocaviruses的ORF3编码蛋白质的大小类似；而bocaviruses的ORF3编码蛋白质相互间相似性较高，PPV4的ORF3编码蛋白质与GenBank非冗余蛋白质数据库中的蛋白质无同源(Cheung，Longeta1．2011)。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉第二部分研究内容第一章PPV2间接ELISA方法的复核摘要：本章对于建立的间接ELISA方法进行了全方面的复核。主要是利用大肠杆菌BL21(DE3)表达含有PPV2．VP2基因的蛋白，而后经过一系列表达条件优化，提取，纯化，复性，得到目的蛋白。利用该蛋白作为抗原包被酶标板，采集自浙江各猪厂血清，经PCR检测为PPV2阳性，各取100弘L血清混合后，作为阳性血清并使用间接ELISA进行确认为阳性血清；采自某猪场未吃初乳新生仔猪血清作为阴性血清；然后摸索包被条件，封闭条件，以及一抗二抗孵育浓度和时间等，建立针对于PPV2．VP2的间接ELISA检测方法：确立的ELISA反应最适条件分别为：抗原包被浓度为2．O陷／mL，血清稀释度为1：25，兔抗猪IgC辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1：1000，待测血清于37℃反应1．5h，底物于室温显色15rain。用建立的ELISA方法对阴性血清进行检测，结果测定平均值在O．143，按公式经计算确定阴阳性OD临界值为0．354。经批内重复性试验和批间重复性试验，CV小于10％，结果表明该方法具有较好的重复性；同时阻断试验呈阳性反应。实验结果表明本文建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、重复性，为进行PPV2流行病学调查提供了一种便捷的手段。细小病毒粒子无囊膜，直径约18～26nm，二十面体对称。基因组为线性、单链DNA，大小约5kb，在5’端和3’端均有发夹结构。基因组有两个主要开放ORF：ORFl和ORF2，前者的产物是基因复制和转录必需(包括NSl，NS2，NS3)，后者编码衣壳蛋白(VPl、VP2、VP3，其中VPl序列最长，VP2序列完全包括在VPl内，而VP3由VP2在蛋白酶的作用下裂解产生)。猪细小病毒2型是近年来新发现的细小病毒科成员之一，它与传统的猪细小病毒亲缘关系较远。本试验利用大肠杆菌表达系统BL21(DE3)。BL21是经典的表达菌株，用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体例如pET质粒的基因。这种表达方法可以在较短时间以相对低的成本获得大量基因表达产物。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉1．材料1．1菌株含有重组表达质粒pET-28a-VP2的BL21(DE3)I扫本实验室保存；1．2培养基和抗生素LB培养基配方：蛋白胨89，氯化钠79，酵母浸出液59，加蒸馏水至1L溶解，调节pH为7．2～7．4，15磅高压灭菌15rain后使用，固体LB培养基是在以上液体培养基中加入199琼脂条。卡那霉素(kanamycin，KanR)购自上海生工生物公司，将其配成10mg／ml母液，分装后，置于-20"C保存。1．3蛋白提取，纯化复性相关试剂和溶液配制蛋白胨和酵母粉购自OXOID；溶菌酶、IPTG、Tritonx．100、咪唑等购自上海生工生物工程技术服务有限公司；吐温-20、尿素均为国药集团化学试剂有限公司；镍琼脂糖凝胶购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司。1．3．1包涵体纯化试剂1)细菌裂解缓冲液50mmol／LTfis(pH8．0)lmmol／LEDTA100mmol／LNaCl2)包涵体洗涤缓冲液l50mmol／LTris(pH8．0)lmmol／LEDTA100mmol／LNaCl2mol／L尿素3)包涵体洗涤缓冲液250mmol／LTris(pH8．O)1mmol／LEDl=A14 浙江大学硕士学位论文姜轲冉20ATritonX-1004)包涵体溶解缓冲液0．5MNaH2P0419ml0．5MNa2HP0481mlNaCl29．39尿素4809加热溶解后定容至1L。1．3．2镍柱纯化试剂1)Buffer1NaClKCl890．29Na2HP041．449KH2P040．249脲4809加热溶解后定容到1L2)Buffer2NaClKClKH2P0489O．290．249Na2I-IP041．449尿素4809咪唑349加热溶解后定容到1L1．3．3复性缓冲液NaClKCl890．29 浙江大学硕士学位论文姜轲冉KH2P040．249Na2HP041．449尿素2409加热溶解后定容到1L1．3．4SDS．PAGE相关试剂1)30％Acr-Bis丙烯酰胺299亚甲双丙烯酰胺19搅拌溶解，定容至O．1L，在棕色瓶中4℃储存2)2mol／LTris：在800mlddH20中溶解242．29Tris碱，分别将pH调至8．8和6．8，加水定容至1L，室温保存。3)10％SDS溶液：109SDS，加水至100ml，搅拌至溶解，室温储存；4)10％过硫酸铵：在．10mlddH20中溶解1．09过硫酸铵，现用现配；5)5x电泳缓冲液：Tris碱1．219甘氨酸5．769lO％SDS4ml溶解于80mlddH20中，溶解后定容至100ml6)上样缓冲液2mol／LTris(pH6．8)0．2mlB．巯基乙醇0．4ml甘油lml10％SDSlml溴酚蓝0．019加ddH20定容至10ml，室温储存7)染色液考马斯亮蓝R2500．59甲醇100ml16 浙江大学硕士学位论文姜轲冉乙酸20ml加ddI-120定容至200ml，室温储存8)脱色液乙醇100ml乙酸100ml加ddI-120定容至1000ml，室温储存1．3．5Bradford法相关试剂1)标准蛋白的溶液：将10．Omg／mlBSA进行稀释，直至1．0mg／ml2)考马斯亮蓝G250溶液考马斯亮蓝G25010mg95％乙醇5ml85％磷酸12ml加ddI-120定容至100ml，置于4"C储存1．4血清1)PCR阳性血清：采集自经PCR检测为PPV2阳性，各取100pL血清混合作为阳性血清。而后使用间接ELISA进行确认。2)阴性血清：采自某猪场未吃初乳新生仔猪血清；3)待检血清：取自华东地区各个猪场的未知血清；1．5ELISA溶液和试剂1)包被液(O．05mol／LpH9．6碳酸盐缓冲液，CBS)，现配现用2)PBST(pH7．4吐温一磷酸盐缓冲液)NaCl89KH2P040．29Na2HP042．99KClO．29Twecn200．5ml加ddH20至1L，室温保存；17 浙江大学硕士学位论文姜轲冉3)封闭液以及血清稀释液1％明胶；5％脱脂奶粉；1％BSA4)pn5．0磷酸盐一柠檬酸缓冲液柠檬酸(19．29／L)0．2mmoFL磷酸盐溶液加ddH20定容至0．1L；5)底物溶液24．3ml25．7ml磷酸盐一柠檬酸缓冲液(pn5．O)100mlOPD100rag30％H2020．2ml(现配现用)6)终止液(2mol／LH2S04)浓硫酸22ml加ddH20定容至200ml：7)兔抗猪IgG辣根过氧化物酶标记抗体：购自北京鼎国生物科技有限责任公司按照说明书进行稀释1．6仪器及材料96孔酶标板；酶标检测仪；新芝超声细胞破碎仪2．方法2．1猪细小病毒2型VP2蛋白的纯化2．1．1表达条件优化试验过程中在不同诱导时间的收集菌液，对其进行SDS．PAGE电泳分析，经染色脱色后判断最优作用时间。2．1．2重组蛋白大量诱导表达将大肠杆菌BL21(DE3)接种于含有10mlLB的锥形瓶中，37。C过夜培养；转接200mlLB液体培养基中，培养约2h后，加入IPTG使得其终浓度为lmmol／L，】R 浙江大学硕士学位论文姜轲冉诱导4h，收集菌液。2．1．3重组蛋白包涵体的洗涤与纯化1)诱导后的菌液经10000rpm离心10min，取沉淀；2)用PBS将沉淀悬浮后，振荡，10000rpm离心10rain，取沉淀；3)在沉淀中加8ml细菌裂解缓冲液和溶菌酶，剧烈震荡lh；10000rpm离心10rain，使用细菌裂解缓冲液重悬，置于．20℃反复冻融两次4)在冰浴条件下进行超声处理，重复两次。5)细菌超声后裂解液经10000rpm离心10rain，弃上清；6)在沉淀物中用2mol／L尿素的包涵体洗涤缓冲液充分溶解，溶液在冰浴进行超声处理；而后，10000rpm离心10rain；7)沉淀用含2％TntonX-100包涵体洗涤缓冲液悬浮，并在室温摇晃lh；而后10000rpm离心10min取沉淀；8)震荡，超声助溶；而后10000rpm离心10rain；9)用Buffer1平衡镍柱3．5个床体积，流速为2ml／min。10)将溶解了目的蛋白的包涵体溶解缓冲液离心，上清用0．45urn滤膜过滤，上样，重复3次，流速为lml／min。11)用Buffer1再洗3．5个床体积，流速为2mVmin。12)用含有40mmol／L咪唑的buffer洗涤杂蛋白，约洗脱下来20ml；而后用400mmol／L咪唑洗脱目的蛋白，洗脱量为8ml。13)用ddH20流洗3次，再用20％的乙醇流洗3次，置于4℃冰箱保存。2．1．4蛋白复性2．1．4．1透析袋处理1)置于2％碳酸氢钠和lmmoL／LEDTA(pH8．O)中煮沸10rain：2)ddH20彻底清洗；3)置于pH8．0的lmmoL／LEDTA中煮沸10rain；4)置于4"C，浸在ddH20，待用2．1．4．2PPV2VP2蛋白复性将用8mol／L尿素溶解的包涵体溶液置于透析袋内，4℃下用含有4mol／L尿 浙江大学硕士学位论文姜轲冉素的透析复性缓冲液中进行复性，每隔12h使用ddH20将其稀释一次，反复进行3次。最后将目的蛋白分装，备用。2．1．5SDS．PAGE电泳2．1．5．1SDS．PAGE分离胶和浓缩胶的配制1)10％分离胶的配制30％Aer-Bis3．3mlH204．0ml2MTris—C1(PH8．8)2．5ml10％AP0．1ml10％SDS0．1mlTEM匣D0．005ml2)5％浓缩胶的配制30％Aer-Bis0．83mlH203．40ml2MTris．Cl(PH6．8)0．63ml10％AP0．05ml1O％SDS0．05mlT]巳1衄0．005ml2．1．5．2SDS．PAGE电泳1)制胶：将配制好的12．5％的分离胶沿玻璃板一侧边缘灌入，并向其中加入lmlddH20。大约O．5h后，倾去水，灌入浓缩胶，插入梳子，室温下0．5h左右，凝胶完全凝固。2)上样：将待测样品煮沸5min，12000rpm离心5min，每个加样孔5山样品。3)电泳：向电泳槽内加入电泳缓冲液，以80V电压电泳，当电泳至分离胶后，改为100v；2．1．6蛋白浓度测定与保存Bradford法检测蛋白浓度：取酶标条，每孔加入200I．aBradford试剂。而后从第一空开始分别加入01xL、0．5pL、1止、1．5}tL、21xL、2．5pL、3止、3．5pL、41xL、20 浙江大学硕士学位论文姜轲冉4．5pL、最后两孔加入1肛L待测蛋白，酶标仪在oD595衄下测出蛋白浓度。而后将确定浓度的蛋白分装储存至．20"C。2．2猪细小病毒2型间接ELISA方法的建立2．2．1反应板均一性的测定使用稀释1000倍后的兔抗猪酶标二抗，包被随机抽取8个酶标条，每孔1009l，在37C'C反应2h。用PBST充分洗涤，每孔加入100沮OPD显色液，测定OD492衄值，得到所有孔的平均值和标准差，计算变异系数。2．2．2抗原包被浓度和血清稀释浓度的测定(棋盘滴定法)1)包被：将复性的VP2．a重组蛋白按以下倍数稀释：0．5pg／ml、l}lg／ml、2pg／ml、4p．g／ml、8pg／ml、16v．g／ml共6个稀释度，每孔1009L，37"(2孵育2h，而后置于4℃包被过夜。2)洗涤：倾倒酶标板孔内液体，每孔200脚BST洗涤，重复3次。3)封闭：加入5％脱脂奶粉封闭，每孔200pL，2h。封闭后进行洗涤。4)一抗孵育：将PPV阳性血清和阴性血清按1：10、1：25、1：50、1：100、1：200进行稀释，组成方阵。每孔加入1009L，37"C反应1．5h。而后，倾去酶标板孔内液体，洗涤。5)二抗孵育：酶标板每孔加入1：1000稀释的HRP-兔抗猪IgGl00pJ．,，37"(2反应lh。而后，倾去孔内液体，洗涤。6)显色：洗涤酶标板后，加入OPD底物溶液，每孔1009L，显色15rain。7)终止：酶标板每孔加终止液50p．L终止反应。8)读数与判断：终止反应后，将酶标板置于酶标仪上检测OD492nm值，通过阳性血清与阴性血清的OD492nm比值确定抗原最适包被浓度和血清最适稀释倍数。2．2．3封闭液的确定以2．2．2中确定的最适抗原包被浓度包被酶标板，分别使用5％脱脂奶粉，1％明胶、1％BSA作为封闭液于37*0封闭2h，进行间接ELISA反应。最后终止反应后，在酶标仪上检测OD492nm值，通过阳性血清与阴性血清比值确定最佳封闭液。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉2．2．4血清最适作用时间的确定以2．2．2确定的最适抗原包被浓度包被酶标板，血清最适稀释倍数稀释血清，分别作用30min、60min、90min、120min，按间接ELISA程序进行；而后通过阳性血清与阴性血清OD492姗比值确定最佳血清最适作用时间。2．2．5酶标二抗孵育时间的确定以2．2．2，2．2．3，2．2．4中确定的最适反应条件进行试验，设置酶标二抗孵育时间的梯度：O．5h，1h，1．5h，2h。通过阳性血清与阴性血清OD492nm的比值确定酶标二抗最佳孵育时间。2．2．6最佳显色时间的确定以前面摸索的最适条件进行间接ELISA，显色时间分别为10min、20min、30min，最后通过阳性血清与阴性血清OD492nm比值确定最佳显色时间。2．2．7建立间接ELISA的阴阳性判断取某猪场未吃初乳的新生仔猪血清，按优化好的条件进行间接ELISA试验。得到10份新生仔猪血清的OD492nm平均值(X)以及标准差(SD)，阴阳性临界值公式为X+3木SD。2．2．8阻断性试验将按最佳稀释度稀释阳性血清，等体积混合最适稀释度稀释的重组蛋白抗原，3712孵育1．5h，将其加入到已包被抗原的酶标孔，测定oD492nm。计算(未阻断孔OD值．阻断孔OD值)／(未阻断孔OD值)。若结果大于O．5，则为阻断阳性；反之，为阻断阴性。2．2．9重复性试验2．2．9．1批内重复性试验同一批重组蛋白包被酶标板，取3份抗体水平不同的血清和l份新生仔猪阴性血清和l份阳性血清，应用建立好的方法进行检测，每份样品重复3孔，而后对结果进行分析。2．2．9．2批间重复性试验取4个批次重组蛋白，经包被、封闭，以相同阳性和阴性血清作为一抗，进22 浙江大学硕士学位论文姜轲冉行检测，每份血清检测3孔，最后对结果进行分析。2．2．10敏感性试验将阳性血清从1：10开始进行倍比稀释，1"10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560，以建立好的间接ELISA条件进行试验，观察可以检出的最低浓度。2．2．1l酶标板保存时期试验将包被好PPV2VP2蛋白的酶标板分别置于40C，．20℃条件下保存，针对不同时间的酶标板采用相同血清进行间接ELISA检测。3．结果3．1蛋白最佳表达条件将含有阳性重组表达的菌接种于10mlLB液体培养基(含501．tg／mlKanR)中，置于37"C，震荡过夜。而后，取100p1转接10ralLB小瓶(含50删KanR)，待OD值达到O．6左右时，加入IPTG进行诱导，每隔1h取样一次。最后对取得的不同诱导时间的菌液离心，结果发现诱导4h左右的菌液条带明显，可以作为最优的诱导时间。而后，经过一系列的超声，沉淀处理，将目的蛋白包涵体溶于8mol／L的尿素缓冲液中，最后进行SDS．PAGE电泳。结果如图1—1所示。1234毒!’iii毒jj著零j零j薰蘩lll毒薹叁：羹雾瀛；桶赫童一泳道1：诱导前；泳道2：诱导4h后；泳道3：超声裂解后：泳道4：8moFL尿素溶解后上清：图1．1SDS—PAGE分析目的蛋白的表达簟藁薰群 浙江大学硕士学位论文姜轲冉Fig．1-1IdentificationofPPV2VP2bySDS-PAGEanalysisl：lysateofpET-28a-PPV2-VP2／BL21(rE3)beforeinduction；2：lysateofpET-28a-PPV2-VP2／BL21pE3)afterinductionwithIPTG；3：cellpelletafterultrasonication；4：supematantaftersolubilizationwith8Murea；3．2PPV2VP2蛋白的纯化和复性对粗提的蛋白用镍柱进行纯化，获得了纯度较高的蛋白。随后的复性可以使变性的蛋白恢复正确折叠方式。12泳道1：8mol／L尿素溶解后上清；泳道2：纯化后目的蛋白图I-2目的蛋白初步提取Fig．1—2SDS-PAGEanalysisofVP2a【p托ssed’isolatedfromE．coli1：supernamntaftersolubility、^，inl8Murea；2：VP2afterpurification；3．3PPV2VP2的浓度使用Bradford方法对得到的蛋白产物浓度进行测定，结果如表1．1所示：表1—1使用Bradford法测定制备抗原的蛋白浓度结果Table1-1Assayofconcentrationofthetargetprotein24一羹篷羹 浙江大学硕士学位论文姜轲冉忙一l图1．I使用Bradford法测定制备抗原的蛋白浓度结果Fig．1-1Assayofconcentrationofthetargetprotein3．4酶标板均一性酶标板的均一性检测检测结果见表1—2经统计学分析，该酶标板各孔间平均值为1．143，标准差为0．0944，变异系数为8．25％，小于10％，故复合试验要求。表1—2酶标板均一性检测Table1-2Assayofhomogcnicityofprotein3．5抗原最佳包被浓度以及血清稀释倍数的测定将经过的重组蛋白作为抗原经O．5，1，2，4，8，16p,g／ml稀释，包被酶标板，37"C放置2h，4"C过夜；而后经PBST洗涤，封闭，将阴性阳性血清以1：10，1：25，1：50，1"100，1：200进行稀释，用兔抗猪IgG—HRP作为酶标二抗进行反应，进过试验。结果如表1—3所示。抗原包被浓度越大，OD492nm越高，随着一抗血清稀释度增大，OD492nm越低。最后，由P／N值可知，目的抗原最佳包被浓度2嵋／ml，同时血清最佳稀释倍数为1：25。表1．3抗原包被浓度及一抗血清孵育浓度的确定Table1-3AssayofthecoatingconcentrationoftheantigenandtheseTum柚曲odydilution21； 浙江大学硕士学位论文姜轲冉3．6最佳封闭液的选择选择3种包被液对酶标板进行包被，而后进行间接ELISA试验。结果发现I％BSA与5％脱脂奶粉表现出的封闭性较好，考虑到经济成本问题，最终选择5％的脱脂奶粉作为封闭液。表1_4封闭液的确定Table1--4Assayofblockingsolution26 浙江大学硕士学位论文姜轲冉3．7血清最适作用时间取阴性阳性血清按前面摸索的条件进行试验，每组做3个重复，3次的平均值见表1．5；可知，当血清作用时间为1．5h时，P／N值最高。将1．5h确定为一抗血清的最佳作用时间。表1．5一抗血清最佳作用时间的确定Tablet1-5Assayoftheoptimaltimefor9髓硼samplereactiontime3．8最佳显色时间取阴性阳性血清按前面摸索的条件进行试验，每组做3个重复，3次的平均值见表1—6。其OD492nm随着显色时间延长也随之增加，当显色时间为15min时，P／N值最高。将15min确定为最佳显色时间。表1-6最佳显色时间的确定Table1-6Assayoftheoptimaltimeforcolordevelopmeat3．9阴阳性临界值的确定生产实际中由于缺少针对PPV2的标准阳性血清，故需要建立阴阳临界值确定方法。以10份未吃初乳的初生仔猪作为阴性一抗血清，按建立好的间接ELISA检测方法进行检测，每份重复3次，检测结果：10份血清的平均值为0．143，标准差为0．0703，按公式：X+3*SD确定间接ELISA的阴阳临界值为0．354。3．10阻断试验将一抗血清和重组蛋白抗原混合后37"C孵育1．5h后，进行试验，结果为：，7 浙江大学硕士学位论文姜轲冉阻断孔OD492nm为0．412，未阻断孔OD492nm为1．236，由公式可知，(N-P)／N=0．667，大于0．5，故为阻断阳性。3．11重复性试验3．12．1批内重复使用同一批制备的重组蛋白包被酶标板，取3份待检血清和阴阳血清，应用建立的ELISA检测方法进行试验，每份样品重复3次，实验结果如表1．7所示，CV平均在10％以下，表示本方法重复性良好。表1．7批内重复试验结果Table1-7Variationamongwellsinthe8anleflate3．12．2批间重复取4批不同时间制备的抗原，以相同的阴阳血清作为一抗，进行间接ELISA反应，每次检测3次，3次平均值如表1．8所示。表1。8批间重复试验结果Table1-8VariationamongDiffereatbatchesAntigea3．12敏感性试验将阳性血清从1：10开始进行倍比稀释，结果发现当阳性血清稀释至l：640时，结果仍然判为阳性，证明敏感性良好。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉3．13酶标板保存时期试验将经过包被的酶标板置于4"C，．20℃条件下保存，在不同时间对酶标板用相同血清进行间接ELISA检测，结果发现，保存于．20"C的酶标板在60天左右OD492nm变化不大，同时在4℃变化相对较大。3．讨论猪细小病毒2型作为近年来新发现的一种细小病毒变异株，由于其在与细小病毒科其他病毒上存在亲缘性相差较大，关于该变异株病毒研究较少等诸多因素下，我们对该病毒的研究还不完全透彻。本实验室在2006年从猪高热病的病料中提取到该病毒，对其开展了一系列的研究。本章试验中，利用已构建好的pET28a-PPV2．VP2质粒，转化进大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中进行表达，经过一系列条件摸索，粗提，纯化，复性过程，得到纯度较高的重组蛋白，利用蛋白作为抗原，包被酶标板，进行间接ELISA检测方法的建立。为了得到高纯度的目的蛋白，对蛋白的粗提，纯化，复性条件进行了一系列摸索。由于该病毒重组蛋白通过原核表达的，因此蛋白结构是以一种被称为包涵体的形式存在于大肠杆菌中，我们将超声破碎，溶菌酶消化以及冻融菌液3种方式结合起来，其目的是使其最大程度地大肠杆菌中释放出来(注意控制超声裂解的时间和强度，防止目的蛋白断裂)，经过多次SDS．PAGE可以看到明显的差异。经过多次离心取沉淀，而后使用1％TritonX-100离子去垢剂进一步去除外膜蛋白，最后将包涵体溶解于8M的尿素缓冲液中。从图1．2可知，经过纯化可进一步除去杂蛋白，在这个过程中，要注意控制洗脱的速度，这会极大影响蛋白的纯度，太快时杂蛋白会随之而带下。而复性则可以使蛋白状态恢复自然条件，同时，也会使蛋白浓度大幅度下降。鉴于间接ELISA所需包被抗原浓度极低，故可以忽略这一不利因素。为了成功构建针对PPV2的间接ELISA检测方法，对每一步的工作时间及稀释倍数进行摸索，最后从敏感性，重复性，特异性三方面证实了该方法的可靠程度。对在构建针对于PPV2-VP2间接ELISA检测方法时，由于缺少标准阳性血清，我们使用了PCR阳性血清的混合血清作为阳性血清，未吃初乳的初生仔猪血清作为阴性血清，确定阴阳性的临界标准是十分重要的。在经过一系列的条件摸索之后，建立了间接ELISA检测方法，而后，对该29 浙江大学硕士学位论文姜轲冉方法进行了验证，从敏感型和重复性，证明方法是可靠的。为下一步试验对华东地区猪场中PPV2的流行情况调查奠定了坚实的基础。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉第二章PPV2间接免疫荧光方法的建立摘要：本章中利用已包装完成的PPV2．ORF2重组腺病毒建立间接免疫荧光的检测方法。在方法建立过程中，对所采用的细胞系，固定液及固定时间，一抗浓度及其孵育时间，二抗浓度及其孵育时间进行了摸索，其中我们选择HEK293A细胞作为培养基，接毒后48h进行抗原板的制备。使用PBS缓冲液缓慢清洗细胞培养板，使用4％的多聚甲醛在．20℃下固定15min，而后将抗原板置于通风处晾干。对一抗血清进行1：20稀释，于37℃反应1h；对羊抗猪FITC标记抗体进行1：200稀释，于37℃反应45min。最后，用50％甘油封片，镜检。同时对建立好的方法的特异性，敏感性，重复性进行确认，结果证明该方法是针对于PPV2的一种可靠的检测方法。为进行间接免疫荧光血清流行病学调查，以及进一步间接ELISA方法进行方法学上的对比奠定了基础。1953年，腺病毒是由Rowe(Rowe，Glimsoileta1．1953)等首次从腺体组织分离得到，故名腺病毒。腺病毒的基因组长约36kb，其两端各有一个反向末端重复区(ITR)，ITR内侧为病毒包装信号。基因组上有早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)两种，早期转录基因为EIA、EIB、E2A、E2B、E3、FA，晚期转录基因为L1、L2、L3、IA、L5。其中E2的产物是后者表达的反式作用因子和复制中所必需的因子，同时E2的表达必需要EIA和EIB产物。因此，E1区的缺失可导致病毒复制失败。E3为复制非必需区，它的缺失可扩大插入容量。目前腺病毒载体主要有E1区和E3区两种表达载体。E1区载体是一种复制缺陷病毒，只能在HEK293细胞系中增殖：E3区为病毒非必需区，故可在大量细胞株上增殖。腺病毒载体在许多实验性基因治疗相关的基础研究中已显示出其良好的应用。从此，腺病毒成为病毒学和分子生物学的重要研究对象，其基因载体系统也有突飞猛进的发展@aul，Halbureta1．2003；Eterpi，McDonnelleta1．2009；Cermelli，Cuoghieta1．2011)o腺病毒载体的主要特点是：(1)增殖滴度高。(2)腺病毒能同时表达多个基因，因此被极其广泛地应用于体外基因转导、和基因治疗等。(3)腺病毒载体并不整合进入宿主细胞基因组，而是以游离状态分布在宿主细胞基因组外，增加了其安全性。31 浙江大学硕士学位论文姜轲冉在该方法建立过程中，对所采用的细胞系，固定液及固定时间，一抗浓度及其孵育时间，二抗浓度及其孵育时间进行了摸索。最后，对建立好的方法的特异性9敏感性，重复性进行确认，结果证明该方法是针对于PPV2的一种可靠的检测方法。1．材料1．1细胞HEK293和HEK293A细胞，来自于浙江大学医学院馈赠1．2血清1．2．1PCR阳性血清采集自浙江各猪厂血清，经PCR检测为PPV变异株阳性，各取1001上L血清混合后，作为阳性血清。而后对其使用间接ELISA进行确认。1．2．2阴性血清采集自某猪场未吃初乳新生仔猪血清；1．3试剂胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；DMEM高糖液体培养基，青霉素，链霉素购自杭州科易生物制品公司；羊抗猪IgG-FITC购自KPL公司；2．方法2．1细胞系的确定同时选取HEK293和HEK293A细胞进行试验，在进行一系列的铺板，接毒，固定，一抗孵育，二抗孵育，镜检之后，选择状态良好的细胞系。2．2接毒后蛋白表达时间的确定在接种重组腺病毒PPV2细胞毒后，每隔12h或24h观察并换液一次，分别≈’ 浙江大学硕士学位论文姜轲冉于培养24h、36h、48h、96h后，取出细胞培养板，进行IFA试验，完成后于倒置荧光显微镜下观察结果。2．3固定液和固定时间的确定以80％丙酮、丙酮：乙醇(5：5)、4％多聚甲醛作为固定液，固定时间分别为5min、10min、15min、20min，棋盘式固定细胞培养板，进行IFA试验，而后比较固定效果。2．4血清的最佳稀释倍数确定按照前面摸索的接毒时间、固定液作用时间，在rAd．PPV2．ORF2接毒孔和未接毒孔分别以1：10、1：20、1：40、1：80、1：100倍数稀释阴性和阳性血清，进行IFA试验，最后进行镜检，确定最佳稀释度。2．5一抗最佳作用时间的确定以前面摸索的最适条件，一抗分别孵育30min，60min，90min进行IFA试验，最后通过镜检确定最佳孵育时间。2．6二抗的最佳稀释倍数确定按照前面摸索的最适条件，在其他条件相同的前提下，分别以1：50、1：100、1：200、1：400、1：800倍数稀释羊抗猪IgG-FITC，进行IFA试验，最后进行镜检，确定最佳稀释度。2．7二抗最佳作用时间的确定以前面摸索的最适条件，二抗分别孵育30rain，60min，90min进行IFA试验，最后通过镜检确定最佳孵育时间。2．8间接免疫荧光结果的判定使用已建立好的IFA方法，对特异性荧光的的标准进行统一化。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉2．9特异性试验2．9．1细胞培养板的自发荧光对照实验分别将未接毒和接有PPV2的细胞培养板直接置于倒置荧光显微镜下，观察是否有荧光产生。2．9．2空白对照IFA试验时，以PBS代替PPV2阳性血清作为一抗，而后加入羊抗猪IgG．FITC二抗，进行IFA试验，最后判断有无荧光出现。2．10IFA敏感性试验在24孔板中培养HEK293A细胞，待其生长成单层细胞平铺孔底约700／0．．-80％；用DMEM高糖培养基将已测定滴度的病毒液按十倍梯度稀释，设101"-'106倍稀释七个梯度，设未接种病毒的细胞为阴性对照，病毒原液接种细胞为阳性对照，分别接种24孔板中；待细胞病变出现后，进行IFA检测；2．11IFA重复性试验取相同批次以及不同批次的细胞培养板，相同批次的阳性血清作为一抗以及相同批次的荧光二抗，进行批内和批间重复试验。在相同的条件下进行IFA试验，观察荧光的强弱是否显著改变。3．结果3．1细胞系的选择由于Adeasy重组腺病毒系统是E1区缺失的，因此只能在HEK293细胞系上生长。于是选择两种细胞系HEK293和HEK293A，由于HEK293有着半贴壁性的特点，这种特点使其在传代过程中可以很好地被消化下来，但也有重大的缺陷。在试验过程中，尤其是固定前洗涤时，细胞极易从细胞培养板上脱落，从而导致试验的意外终止。而后者明显比前者具有更好的贴壁性，因此我们在试验中 浙江大学硕士学位论文姜轲冉选择HEK293A细胞系。3．2蛋白表达时间的选择对4个接毒时间(12h，24h，48h，96h)分别进行IFA试验，同时每天更换新鲜的DMEM高糖培养基，结果发现：接毒时f日qd,于48h时，蛋白表达量略显不足，而96h时，大多细胞圆缩死亡，结果见图2．1，2．2，2—3。图2—1接种病毒后24hFig．2—1HEK一293AcellsafterinfectedrAd—PPV2-ORF224hrs图2-2接种病毒后48hFig．2-2HEK-293AcellsafterinfectedrAd-PPV2-ORF248hrs35 浙江大学硕士学位论文姜轲冉图2—3接种病毒后96hFig．2—3HEK-293AcellsafterinfecteArAd-PPV2一ORF296hrs3．3固定液以及固定时间的选择同时使用80％丙酮、丙酮：乙醇(5：5)、4％多聚甲醛进行IFA，根据细胞脱落，荧光强度等判断最佳固定液和固定时间。结果发现在使用4％的多聚甲醛，一20"(2环境下，固定时间为15min时，固定效果最佳。丙酮细胞固定剂固定后，会出现腐蚀细胞培养板，细胞固定不牢等缺点。3．4一抗、二抗最佳稀释倍数及作用时间的选择由实验结果可知当对荧光抗体进行1：200稀释，孵育45rain时，特异性荧光最强，同时有着最弱的非特异性荧光；一抗血清进行1：20稀释孵育1h时，荧光效果较好。3．5间接免疫荧光最佳作用程序及结果判定使用HEK293A细胞在24孔细胞培养板上进行铺板，待细胞长满70％左右以1：104稀释度接毒，每天更换新鲜的DMEM高糖培养基，48h后倾去培养液，用PBS小心清洗3次，之后加入4％多聚甲醛于．20℃固定15min，取出后再次用PBS清洗，置于通风柜晾干使其完全干燥，而后置于．20℃保存；加入1：20稀释的一抗血清(包括阴性，阳性和待检血清)于37"C湿盒孵育1h，用PBS清洗3次；加入1：200稀释的羊抗猪IgG-FITC二抗，37"C孵育45min，取出后用PBS小心清洗3次。最后，用50％的甘油封片镜检。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉如图2-4，2．5所示，在荧光倒置显微镜下，通过蓝光激发，阳性可以看到明显的特异性绿色荧光，判定为+，而阴性则没有，判定为．。对于可疑的样本，+／．，则应该做重复性试验。图2_4IFA阳性检测结果Fig．24DetectionofthePPV2structuralproteinexpressioninHEK-293ceUsinfectedwithrAd-PPV2一ORY2byIFA(positive)图2．5IFA阴性检测结果Fig．2-5DetectionofthePPV2structuralproteinexpressioninHEK-293cellsinfectedwithrAd-PPV2一ORF2byIFA(negative) 浙江大学硕士学位论文姜轲冉3．6IFA特异性试验3．6．1自发荧光性检测现。试验结果发现，在非接毒孔并没有明显的可以干扰试验结果的自发荧光出3．6．2空白对照在做IFA试验时，以PBS代替阳性血清作为一抗，观察羊抗猪IgG-FITC二抗本身有无特异性反应，结果发现细胞培养板内无特异性荧光出现，呈现阴性结果。3．7IFA敏感性试验将阳性血清以1：5，1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560倍比稀释后，进行IFA试验，试验结果发现在稀释度1：160时，检测结果仍为阳性，说明敏感性良好。3．8IFA重复性试验取6份抗体水平不同的血清样品在同一培养板中，每份样品平行作3次(批内)；同时，3次重复测定6份样品(批间)，观测批内批间差异。观察结果显示批内批间没有显著差别(荧光图片略)。4．讨论本章针对在重组腺病毒载体中表达PPV2ORF2的建立了间接免疫荧光检测方法，对所使用的细胞系，蛋白表达时间，固定液及固定时间，一抗二抗稀释倍数和孵育时间进行摸索，同时对建立好的方法进行敏感性，特异性，重复性确认，结果证明该方法是可靠的。在间接免疫荧光方法建立过程中，抗原固定是非常重要的一个环节。在试验前期，按照Adeasy腺病毒重组系统相关文献，该系统是腺病毒E1缺失区，只能在HEK293系统生长。我们在该步骤遇到了极大的困难，由于HEK293细胞是半贴壁式细胞，这为细胞传代过程提供了易于消化的优点。但同时，在固定时， 浙江大学硕士学位论文姜轲冉该特点成为了致命的缺点，特别是固定前用PBS洗涤过程中，大量细胞脱落；，通过查阅大量文献，改用HEK293A细胞系，该细胞系是HEK293的改良系，有着更好的贴壁性。对比了两种结果后，采用HEK293A细胞试验。抗原的固定过程，不仅要使抗体易于和抗原结合，同时不能损失目的抗原的活性。因此，针对不同的抗原，需要选择不同的固定液及固定时间。常用的固定液是丙酮和4％多聚甲醛，由于丙酮对细胞培养板有较强的腐蚀性，故不宜采用；固定时间也应该进行进一步确定，长时间固定可能会影响病毒抗原。最后，经过试验，选择了4％的多聚甲醛作为固定液在．20"C将HEK293A细胞固定15rain的固定策略。一抗血清和二抗的孵育浓度及时间会极大影响最终的背景，浓度过大和过长时间孵育会导致背景过深，同时在孵育时加入1％BSA可以起到很好的封闭作用，有降低背景的作用。经过试验，确定一抗的孵育浓度为1：20，时间为lh；二抗反应浓度为1：200，时间为45rain。经过以上条件的摸索，有效降低了非特异性荧光的干扰。由于羊抗猪IgG-FITC的二抗有着易于淬灭的特点，所以在进行镜检时应注意不要耗费过长时间，在无淬灭剂的情况下，可以在细胞培养板的空中滴入50％的甘油减缓淬灭。最后，通过对反应板自发荧光，空白试验等进行试验，发现相关特异性较好。而后的重复性试验表明可重复性较强，虽然敏感性试验结果较间接ELISA低，也在稀释倍数为1：160时显示阳性。综上，该方法可以较好地应用于临床样品的检测。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉第三章使用间接ELISA方法和间接免疫荧光方法进行血清流行病学的初步调查摘要：利用已建立好的PPV2间接ELISA和间接免疫荧光方法对采集自于华东地区12个不同猪群的357份血清进行检测，试验结果显示，阳性血清数分别为138和130份，不同批次的血清在两种检测方法中表现出了不同的阳性率，而总体阳性复合率是71．8％。以上数据可以初步了解了华东地区的PPV2流行情况，为进一步疾病防控提供了数据支持。PPV2是新近发现的病毒变异株，其流行特征不明确。2001年，Hijikm等在研究戊型肝炎(mⅣ)时意外分离到PPV2毒株。2006年本实验室竺春在浙江爆发高热病的猪的血清中首先检测到3株PPV2毒株。因此，关于PPV2相关的研究较少。在试验室检测方法中，血清流行病学是一种很重要的检测手段。可以通过抗体效价来准确地反映其疾病的流行情况。PCR、斑点杂交，核酸探针等核酸学方法，而这些方法通常需要扑杀动物采集动物的器官组织。而血清样品的采集简单，不需要扑杀动物。为大规模开展PPV2感染的流行病学调查，有必要建立一种简便有效的“非损伤性”检测方法。本实验利用重组PPV2-VP2蛋白建立间接ELISA；同时利用PPV2．ORF2重组腺病毒建立了间接免疫荧光检测方法。两种方法同时对血清流行病学进行调查，从而掌握PPV2在华东地区的流行情况。1．材料1．1．血清1．1．1．阳性血清采集自浙江各猪厂血清，经PCR检测为PPV变异株阳性，各取100pL血清混合后，作为阳性血清。经间接ELISA对其进行确认。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉1．1．2．阴性血清采自某猪场未吃初乳新生仔猪血清；1．1．3．待检血清采集自华东地区猪场的357份未知血清1．2．试剂见第一章和第二章试剂部分1．3．试验仪器见第一章和第二章仪器部分2．方法2．1．间接ELISA试验对待检血清检测2．1．1．包被将复性的VP2．a重组蛋白按2IItg／ml倍数稀释，每孔lOOoL，37*(2孵育2h，而后置于4"C包被过夜。2．1．2．洗涤倾倒孔内液体，每孔200衄BST洗涤，每次洗涤3min，重复3次。2．1．3．封闭加入5％脱脂奶粉进行封闭，每孔200I_tL，封闭2h。封闭后进行洗涤。41 浙江大学硕士学位论文姜轲冉2．1．4．一抗孵育用血清稀释液将PPV阳性血清和阴性血清以及待检血清进行1：25稀释，组成方阵。每孔加入100pL，37"C反应1．5h。而后，倾去孔内液体，洗涤。2．1．5．二抗孵育每孔加入1：1000稀释的HRP．兔抗猪IgG100pL，37。C反应1h。而后，倾去孔内液体，洗涤。2．1．6．显色洗涤后，加入OPD底物溶液，每孔100pL，显色15min。2．1．7．终止将酶标板中每孔加入终止液50此对反应进行终止。2．1．8．读数与判断终止反应后，在酶标仪上检测OD492nm值，通过阳性血清与阴性血清OD492nm比值确定抗原最适包被浓度和血清最适稀释倍数。2．2．间接免疫荧光对待检血清检测2．2．1．抗原板的制备使用HEK293A细胞在24孔细胞培养板上进行铺板，待细胞长满70％左右以1：104稀释度接毒，每天更换新鲜的DMEM高糖培养基，48h后倾去培养液，用PBS小心清洗3次；42 浙江大学硕士学位论文姜轲冉2．2．2．固定加入4％多聚甲醛于．20"C固定15rain，取出后再次用PBS清洗，置于通风柜晾干，而后置于．20"C保存；2．2．3．孵育加入1：20稀释的一抗血清(包括阴性，阳性和待检血清)于37"C湿盒孵育1h，用PBS清洗3次；加入1：200稀释的羊抗猪IgG．FITC二抗，37"C孵育45rain，取出后用PBS小心清洗5次。2．2．4．镜检用50％的甘油封片，置于荧光倒置显微镜下进行镜检3．结果经过对来自于12个不同猪场的357份血清使用两种已建立的检测方法进行检测，得到了相关血清流行病学调查数据，总体阳性复合率为71．8％。结果如图3—1所示。表3-1PPV2血清流行病学检测结果Fig．3—1resultofEpidemiologiealInvestigationofPor6．neParvovimstype2BasedoniELISAandIFA43 浙江大学硕士学位论文姜轲冉4．讨论血清学诊断是流行病学调查检测，甚至于预测重大疾病的重要检测手段。目前应用较多的两种抗抗体检测方法为间接免疫荧光和ELISA各有利弊，不同的检测方法极大影响着实验的结果。与分子生物学方法比较，间接免疫荧光法虽可能不及分子生物学检测手段的灵敏度，但操作简单，特异性高。此前利用腺病毒载体成功制备了PPV2一ORF2重组病毒，并建立了PPV2间接免疫荧光检测方法。而后证实该方法具PPV2特异性，与常见的猪病3种病毒无交叉反应，灵敏度相对较高，多次在同一稀释度检出阳性细胞，表现出良好的重复性。但同时间接免疫荧光为半定量实验手段，只能定性地确定被检血清是否为抗体阳性，从荧光强度观察抗体高低情况，但无法反应抗体水平细微差异；同时，需要试验周期较长，对操作者细胞相关操作有一定要求，而且不能进行高通量筛选。因此，与此同时，利用pET28a-PPV2-VP2通过原核表达建立PPV2间接ELISA检测方法，它能很好地显示血清中PPV抗体效价，可以对抗体水平进行一定程度的量化。ELISA以OD值取代了特异性荧光，从实现高通量，定量测定抗方面来说更加客观、快速，能通过定量结果的来反映PPV流行，但存在相对多的假阳性的问题，因此该方法可通过与IFA联合使用进行检测。本研究表明，IFA相对于间接ELISA灵敏性小于后者。血清中PPV2抗体一个重要指标，它的水平与猪细小病毒病及其它相关疾病密切相关，因此作为一个好的检测方法，必须能够进行准确、灵敏的检测，即准确定量检测和基于定量浓度细微变化。通过本实验室IFA和ELISA两种抗抗体检测方法学上比较可知，由于抗原、抗原包被技术以及检测方法的不同，两种方法差异有统计学意义。因此联合检测时，以高通量、敏感性较高的ELISA进行抗体初筛；对于可疑血清44 浙江大学硕士学位论文姜轲冉利用IFA进行再次检测，可以同时实现高敏感性、高特异性检测。在检测得到的试验结果显示，不同批次的血清在两种检测方法中表现出了不同的阳性率，总体阳性复合率是71．8％，就造成该结果的原因分析如下：由于间接ELISA所使用的抗原来自于大肠杆菌表达系统，那么在蛋白提取纯化过程中，可能存在有残余的大肠杆菌相关蛋白，从而轻微影响了间接ELISA的个别结果，造成了假阳性的存在；同时通过文献得知，在不同年龄的猪血清中存在可能会影响间接ELISA结果的蛋白。45 浙江大学硕士学位论文姜轲冉全文总结1．本试验利用pET28a-PPV2-VP2质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经过一系列对VP2的提取，纯化，复性得到目的蛋白作为抗原，建立了针对于PPV2的间接ELISA检测方法，经敏感性，重复性试验证明该方法可靠性。2．本试验利用经过PPV2．ORF2重组腺病毒感染HEK293A细胞，经过对接毒时间，固定液及其固定时间，一抗血清孵育浓度及时问，二抗羊抗猪IgG．FITC的孵育浓度及时间进行摸索，建立了基于PPV2．ORF2的间接免疫荧光检测方法。最后，从特异性，敏感性，重复性试验证明该方法是可靠的。3．来自于华东地区猪场的357份血清分别用建立好的间接ELISA和间接免疫荧光的检测方法进行检测，对检测结果进行分析，并进行了方法学上的比较，结果发现，在进行血清流行病学进行调查时，单一的检测方法不完全可靠。以高通量、敏感性较高的ELISA进行抗体初筛；对于可疑血清利用IFA进行再次检测，可以同时实现高敏感性、高特异性检测。两种方法对辅助监测PPV2抗体水平以及掌握流行病学规律有着较大意义。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉参考文献Bachmann，P．A．(1972)．Porcineparvovirusinfectioninvitro：astudymodelforthereplicationofparvoviruscs．I．Replicationatdifferonttomporaturcs．1．ProcSocExpBiolMed140(4)：1369-1374．Bachmann，P．A．andICDanncr(1976)．Porcineparvovirusinfectioninvitro：astudymodalforthereplicationofparvovimses．II．Kineticsofvirusandantigenproduction．ZcntralblVetcrinarmedB23(5·6)：355-363．Bachmann,P．A．，B．E．Sheffy,eta1．(1975)．Experimentalinutcroinfectionoffetalpigswithaporcineparvovirus．InfectImlnun12(3)：455-460．Cartwright,S．E，Huck,R．A(1967)．V'mmesisolatedinassociation丽mherdinfertility,abortionsandstillbirthsinpigs．VetRec81：196-197．Cmvmght,S．E，M．Lucas，eta1．(1969)．AsmallhaemagglutinatingporcineDNAvirus．I．Isolationandproperties．JCompPathol79(3)：371-377．Cermdli，C．，A．Cuoghi，eta1．(2011)．Invitroevaluationofantiviralandvimcidalactivityofahighmolecularweighthyaluronicacid．VkolJ8：141．Cheng,KC．，GL．Smith,eta1．(1986)．HepatitisBviruslargesurfaoeproteinisnotsecretedbutisimmunogenicwhenselectivelyexpressedbyrecombinantvacciniavirus．JVirol60(2)：337-344．Cheung,A．K．(2009)．Homologousrecombinationwithinthecapsidgeneofporcineeircovirustype2subgroupVIrusesvianaturalCo-infection．ArchVkol154(3)：531．534．Cheung,A．K，J．X．Long，eta1．(2011)．TheRNAprofileofporcineparvovirus4，aboca-likevirus，isuniqueamongtheparvoviruses．ArchVirol156(11)：2071．2078．Cotmom，S．E，L．J．Sturzenbecker,eta1．(1983)．TheautonomousparvovirusMVMencodestwononstrueturalproteinsinadditiontoitseapsidpolypeptides．Virology129(2)：333—343．47 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浙江大学硕士学位论文姜轲冉Vasudevacharya,J．，S．Basak,eta1．(1989)．Nucleotidesequenceanalysisofthecapsidgenesandthefight-handterminalpalindromeofporcineparvovirus，strainNADL-2．Vkology173(2)：368-377．Vigouroux，S．，YFurukawa,eta1．(2003)．Peptidaseactivitiesofthe20／26Sproteasomeandanovelproteaseinhumanbrain．JNeurochem84(2)：392．396．Waldvogel，A．S．，S．Broll，eta1．(1995)．Diagnosisoffetalinfectionwithporcineparvovirusbyinsimhybridization．VHMicrobiol47(3-4)：377—385．Westenbrink,E，M．A．Veldhuis，eta1．(1989)．Anenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectionofantibodiestoporcineparvovirus．JV'埘olMethods23(2)：169．178．Zhang,C．E，C．P．Song，eta1．(2010)．Reproductivefailureinwildboarsassociatedtoporcineparvovirusinfectionandinvivoandinvitrocharacterizationofthecausalisolate．TropAnitaHealthProd42(8)：1611-1613．Zhou,H．，QYao，eta1．(2010)．ProductionandpurificationofVP2proteinofporcineparvovirusexpressedinaninscct-baculovimscellsystem．VlrolJ7：366．梅淼，陈燕凌，eta1．(2012)．PCV2ORF2B细胞表位与PPVVP2真核表达质粒的构建及其免疫原性．中国兽医科学(01)：39掣．董齐，韩孝成，eta1．(1999)．应用间接免疫荧光技术快速检测猪细小病毒抗原．中国预防兽医学报(01)：59．62．刘俊辉，龚振华，eta1．(2004)．PCR与病毒分离检测PPV感染的相关性研究．中国动物检疫(10)：23．24．刘业兵，王晶钰，eta1．(2007)．陕西省规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查．中国动物检疫24(1)：2．吴文学，黄．付．李．张．蒋．张．陈．(2011)．环介导等温扩增技术快速检测猪细小病毒的试验．中国兽医杂志．张跃伟，李旭妮，eta1．(2010)．荧光显色在环介导等温扩增(LAMP)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用．农业生物技术学报180)．贾赞，芦银华，cta1．(2004)．猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小51 浙江大学硕士学位论文姜轲冉病毒混合感染的流行病学调查．中国病毒学19(5)：4．黄瑜，甘孟侯，刘尚高(1995)．银加强胶体金技术检测猪细小病毒的研究．畜牧兽医学报(03)：239-244．潘雪珠，叶向阳，严仲烈(1983)，eta1．猪细小病毒S．1株的分离和鉴定【J】．上海畜牧兽医通讯(1)：1-3． 浙江大学硕士学位论文姜轲冉本研究创新点及后续研究1．本实验的创新点：(1)本试验首次对猪细小病毒2型ORF2的重组腺病毒进行间接免疫荧光检测方法的构建，并以该方法进行了血清流行病学的初步调查，这为诊断防控PPV2奠定了基础；(2)本试验首次对PPV2间接ELISA方法和间接免疫荧光检测方法进行了方法上的对比，为达到更快速准确诊断PPV2起到了较好的探索作用。2．后续工作：(1)使用重组腺病毒免疫实验动物，制备PPV2衣壳蛋白的单克隆抗体对其免疫原性进行研究，最终为基因工程疫苗的研究奠定基础。(2)针对PPV2与细小病毒其他成员亲缘型差距较大的特点，进行相关比较基因组学研究。 浙江大学硕士学位论文姜轲冉附录一实验仪器及设备台式离心机：TDL-5A飞鸽牌生化培养箱：油电二用恒温培养箱(上海国营东风医疗器械厂)台式冷冻高速离心机：BR4i型(法国Jouan公司)电泳槽、电泳仪：DYY-5型电泳仪(北京六一仪器厂)二氧化碳培养箱：美国SHELLAB公司水浴锅：北京精科华瑞仪器有限公司微波炉：广东格兰仕集团有限公司倒置显微镜：南京江南光电股份有限公司凝胶成像分析系统：S-300凝胶图像分析系统(上海培清科技有限公司)超声细胞破碎仪：宁波新芝J1『98型超声细胞破碎仪酶标仪：ThermoMK3型酶标仪 浙江大学硕士学位论文姜轲冉附录二攻读硕士期间参与的课题与发表的论文1．攻读硕士期间参与的课题：(1)PPV2间接ELISA检测方法的建立和初步应用；(2)表达PPV2ORF2基因重组腺病毒的构建；(3)PPV2间接免疫荧光检测方法的建立及初步应用2．攻读硕士期间发表的论文：(1)姜轲冉撑，胡东健撑，孙红霞等鹅圆环病毒抗体间接ELISA检测法的建立．中国预防兽医学报 浙江大学硕士学位论文姜轲冉致谢两年的硕士研究生生涯匆匆而过，短暂，充实是我这两年的关键词，但最重要的是，就在这两年，我走出了迷茫，找到了自己心中那个柏拉图和毕加索的连接点⋯科研。值此论文完成之际，我要感谢浙江大学，是你的广博让我去感悟各个学科的科学前沿，感谢动物科学学院，是你让我沉浸于科学的海洋。感谢我的导师余旭平副教授。本论文是在余老师的悉心指导下完成的，是他把我领进了神圣的科学殿堂，他渊博的知识，严谨、求实的治学态度，富于开拓性的思维和一丝不苟的工作作风将会给我一生带来重大的影响。感谢我挚爱的父亲母亲，是他们养育我长大，是他们教育我做一个怎样的人，是他们在我的人生一度遭遇低谷时始终在背后默默地支持着我。感谢动物预防医学研究所的所有老师，特别要感谢杜爱芳教授，方维焕教授，感谢孙红祥教授，马有智副教授，正是在他们的帮助下我的实验得以顺利完成。感谢本实验的所有成员，创造了一个团结、互助、和谐的氛围，为我的生活和学习带来极大的便利。感谢我的师兄弟姐妹，他们是郭婧、徐雅萍、林蕾、袁海霞、栗文文、郭春、任妮妮、相国、刘云惠等，是他们与我共同分享着实验中的酸甜苦辣，使我在这样一个温馨的大家庭中感受到了温暖。感谢预防所的所有同窗，正是他们不仅实验上给予我帮助，而且是我生活中不可多得的朋友。最后，感谢参加本文评阅、答辩的各位专家，给我提出宝贵的修改意见。姜轲冉2012年5月10日