四川省猪嵴病毒病流行病学调查及间接elisa抗体检测方法的建立

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四JII农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：砾蕾阳l牛if-6月f旧关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和

2、电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。。本论文不保密。。本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上。内划“4”)研究生签名：导师签名‘砾蕾妙乡宇文如l牛年6月ff日7，‘中年6月I／日万方数据中文摘要猪嵴病毒(Porcinekobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)嵴病毒属(Kobuvirus)成员。2008年，匈牙利学者首次报道在无临床症状表现的猪粪便中发现猪

3、嵴病毒；2009年，在中国猪群中也检出了猪嵴病毒。自此之后，多个国家报道在猪群中检测到猪嵴病毒，包括泰国、臼本、韩国、荷兰、巴西、西班牙、意大利、东非等。猪嵴病毒是一种具有传染性、在世界范围内广泛分布的新型病毒，在腹泻猪中有较高检出率，认为可能是猪腹泻的病原，但鉴于其在没有腹泻的猪群中也普遍存在，且目前尚未能实现体外分离培养，需要更多的研究来阐明其生物学特性及病原特性。本研究旨在对四川地区猪嵴病毒病流行情况进行调查，并对四川株猪嵴病毒VPI基因分子流行病学特点进行分析；VP]蛋白是嵴病毒暴露在最外面的结构蛋白，是嵴病

4、毒的优势免疫蛋白，本研究通过大肠杆菌表达系统，表达猪嵴病毒VPl蛋白优势抗原表位区，利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接ELISA方法，为今后猪嵴病毒血清学诊断方法的研究奠定基础。本研究在2011．2012年从四川猪场中收集了163份猪粪便和肠道组织样品，其中112份来自腹泻猪，51份来自没有腹泻的猪。利用RT-PCR方法对样品进行检测，猪嵴病毒的总阳性率为53．4％(87／163)，腹泻样品中猪嵴病毒总检出率为64．3％(72／112)，采集自无腹泻猪的样品中，猪嵴病毒的感染率为29．4％(15

5、／51)。利用SPSS21．0软件对腹泻组数据和无腹泻组数据进行卡方检验，结果显示猪嵴病毒感染和腹泻具有极显著相关性，2=17．126，P=3．5×10一；在哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和成年母猪中，猪嵴病毒的感染率依次为：66．7％、39．1％、23．5％、40．0％，对四个年龄段感染数据进行卡方检验，分析显示哺乳仔猪和猪嵴病毒感染具有极显著相关性，，=10．941，P=9．4x10卅。腹泻猪和幼龄猪可能对猪嵴病毒更易感。利用RT-PCR扩增猪嵴病毒VPl基因序列，通过分子克隆，测序得到35个猪嵴病毒VPl基因序列(G

6、enBank登录号：KFl57917-KFl57951)，核苷酸序列相似性为80．7％一100％，氮基酸序列相似性为87．2％．100％。利用MEGA5．0软件对猪嵴病毒VPl基因序列进行系统进化分析，结果显示本研究获得的四川株猪嵴病毒分属于四个大的分支，说明多株猪嵴病毒在四川地区流行，进化树显示猪嵴病毒VPl基因序列的分群无明显地域性差异。通过序列分析，表明在两只猪的粪便样品中分别检出3株和2株猪嵴病毒共同感染，首次为多株猪嵴病毒共感染提供了依据；通过重组分析软件㈣荨j『删7～㈣绁脚1～㈣姐万方数据RDP和Simp

7、lot预测，发现3株共感染的猪嵴病毒A1、A2、A3之间存在重组事件，A2序列的VPl区段可能是由于A1和A3之间发生重组产生的。重组事件的发生会推动病毒基因组的进化，导致基因多样性的发生。本研究通过BepiPred、Bcepred、DNAStar中Protean来预测分析猪嵴病毒VPl蛋白线性抗原表位，综合各种预测结果，选择抗原表位较集中、抗原指数较高的前半段(1—462bp)作为猪嵴病毒优势抗原表位区，将选取的基因片段送公司进行密码子优化后合成基因，将合成的基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+)00，构

8、建重组表达质粒pET32一VPl，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达，通过对诱导条件进行优化，确定37。C，0．2mmol／LIPTG诱导表达4h为最佳诱导条件，重组蛋白大小为35．6KDa，以可溶性形式存在，在Westernblot检测中，通过Ni柱纯化的VPl重组蛋白和猪嵴病毒阳性血清存在特异性反应，说明重组蛋白具有良