葡萄籽中原花青素的提取纯化及其结构和功能研究

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1、江南大学博士学位论文葡萄籽中原花青素的提取纯化及其结构和功能研究姓名：李春阳申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：许时婴20060301摘要摘要葡萄是世界上经济价值较高的一种水果，为葡萄科(Ⅵtacc∞)葡萄属(vi虹s)植物。葡萄果实中含有大量的酚类物质，其中30-40％存在于葡萄皮中，60一70％存在于葡萄籽中。原花青素口roa砒ocy锄id旭简称Pc)是葡萄籽中含量最大的酚类物质，具有高度羟基化的结构，能够抗氧化、清除自由基、治疗心血管疾病，有很大的开发利用价值。经改良的香草醛一盐酸法测定原花青素含量的精密度、准确度比原方法有明显提高，而且大大提高了显色稳定性，缩短了分析时间

2、。改良后的测定方法快速、简便、有效，可用于葡萄皮、籽、梗及其提取物中的游离态原花青素含量测定。在正丁醇一盐酸液中加入SDS和2-巯基乙醇，能够将结合态中的原花青素分离出来，通过显色反应确定结合态原花青素的含量，其测定结果的精密度和稳定性较好，可用于葡萄籽、梗中蛋白结合态和纤维素结合态原花青素含量的测定．葡萄籽中游离态、蛋白结合态、纤维素结合态原花青素含量分别为3．86％、2．93％、2．80％。在低温条件下贮藏，铝箔真空包装可减少多酚和游离态原花青素的损失以及向结合态原花青素的转化。以真空干燥葡萄籽为原料，用70％乙醇提取葡萄籽原花青素，其最佳工艺参数为葡萄籽粉粒度80．150目、搅拌

3、时间55min、提取温度15℃、加酸量0．75％。20℃时，HP．2MGL树脂对葡萄籽原花青素的纯化效果最好，吸附率为91．1％，解吸率为95．8％。经HP-2MGL纯化的GsPP3组分的原花青素含量为96．5％，明显高于GsPPl和GSPP2。LC．MS分析结果表明，GSPP3质谱总离子流共有27个峰，说明GSPP3组分中原花青素的组成较为复杂，其中2号峰和4号峰的质谱及碎片信息表明，它们是原花青素二聚体。用SephadexI，H．20对GSPP3组分进一步纯化，用70％丙酮洗脱得到GSPP3一sPl和GSPP3一sP2两个组分。LC-MS分析表明，GsPP3．SPl有四个峰，GsP

4、P3．sP2有七个峰，通过质谱及碎片信息分析，它们主要含有单体和二聚体原花青素。根据葡萄籽原花青素提取物GsP和纯化级分GsPPl、GsPP2、GsPP3红外谱图分析，发现葡萄籽原花青素基本结构单元主要为原花青定。利用LC—Ms对葡萄籽原花青素醇解产生的花色素进行分析测定，确定为矢车菊素，从而证明葡萄籽原花青素主要结构单元为花青定，即其B．环上含有两个羟基。激光光散射与GPC联用测定了葡萄籽原花青素纯化分级级分的重均相对分“子质量，乙酰化G8P的平均相对分子质量为9．39×104Da，相对分子质量分布范——围较宽，多分散系数为1．65；乙酰化GsPP3的重均相对分子质量为9．“×10’

5、Da，GsPP3的重均相对分子质量为4．26×103Da，平均聚合度为13，多分散系数为1．56，相对分子质量分布曲线呈对称分布，以高聚合度原花青素为主；乙酰化GSPP3．sP的重均相对分子质量为4．25×103Da，GSPP3-SP的重均相对分子质量屯{l彳’气≥’o，扛南大学博士论文为1．89×103Da，平均聚合度为6，多分散系数为1．45，分子量分布曲线基本呈对称分布，以低聚合度原花青素为主。DPPH法测定葡萄籽原花青素抗氧化实验结果表明，葡萄籽原花青素纯化物抗氧化、清除自由基的能力大于Vc和芦丁；茶多酚与GsPP3接近：葡萄籽原花青素提取物略低于Vc，但高于芦丁。GsP、GS

6、PPl，GSPP2、OsPP3、GsPP3一sP、Vc、芦丁、茶多酚的半抑制量分别为118．01、92．59，88．20、86．07、62．80、110．24、169．88、86．569／kg【DPPH·】，其自由基清除能力AE分别为0．85×lo．2、1．08×10。2、1．13×lo．2、1．16×10皂、1．59×10。2，O．91×10之、O．59×lO。2、1．16xl扩．小鼠血清生化指标和病理切片研究表明，葡萄籽原花青素可以降低高脂模型小鼠血清总胆固酵和低密度脂蛋白胆固醇的含量，对小鼠的肝脂肪变有一定的缓解和治疗功能。葡萄籽原花青素对酵母菌的最小抑制浓度>lOmg／n1L，

7、对大肠杆菌的最小抑制浓度为1．25mg，mL，枯草芽孢杆菌的最小抑制浓度为313pg^nL。葡萄籽原花青素对龋齿菌(即变异链球菌S仃eptococc峭mmans)具有较强的抑制作用，100峙hnL时抑菌圈直径为lOrnm，250“咖L时为14mm，500峙，mL时为20mm。葡萄籽原花青素对沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，当含菌量约为100个／n1L、原花青素浓度为500“g／埘【L时，对金黄色葡萄球菌抑菌率为29．6％