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1、shRNA表达载体pWHl构建和用于HIF1基因沉默摘要：目的：构建用于RNAi的shRNA(smallhairpinRNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子1(HypoxiainducibleFactorl,HIF1)基因的沉默效果。方法：从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子，克隆入酶切处理后的pEGFPCl载体片段中，此载体命名为pWHlo以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物，退火后克隆入pWHl。新的载体转染SGC7901细胞，然后用RTPCR和Westernblot检测HIF1基因的表
2、达改变。结果：构建的pWHl载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RTPCR和Westernblot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论：成功构建了shRNA表达载体pWHl,这对于基因的功能研究具有重要的意义。关键字：shRNA表达载体RNA干涉HIF1基因RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂(PTGS)的一种。1998年，Fire等［1］在利用反
3、义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现，由正义和反义RNA退火形成的dsRNA引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义RNA强10倍以上。dsRNA引起的基因表达抑制不是正义或反义RNA引起的基因表达抑制在数学上的叠加，这就说明dsRNA触发了细胞内的一些反应机制，从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时,他们就把这种现象命名为RNAioRNAi的应用谱非常广泛，从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫，其次就是果蝇。哺乳动物细胞的RNAi应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。Wi
4、anny等［2］将dsRNA用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了RNAioSayda等［3］用人工合成的21ntRNA二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了RNAioBrummelkamp等［4］利用载体表达的shRNA在许多培养的人源，猴源和鼠源的哺乳动物细胞的RNAi实验中取得了成功。在真核细胞内，RNA聚合酶III能指导短RNA的表达和RNA聚合酶III结合的启动子有Hl,U6等。目前，这两种启动子都被尝试作为表达短RNA的工具。本实验旨在克隆得到的H1启动子的基础上构建一个能稳定表达shRN
5、A的真核载体。然后针对HIF1基因mRNA设计靶标，在培养的SGC7901细胞（胃癌细胞系）内进行RNAi实验，以观察新建的pWHl载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。1材料和方法1.1材料pEGFPCl质粒为CL0NTECH公司产品；各种限制性内切酶为NEB公司产品。T4连接酶、PfuDNA聚合酶和DL2000DNAmarker为TaKaRa公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。SGC7901细胞由全军消化病研究所保存oSuperscriptII反转录试
6、剂盒购自Invitrogen公司；兔抗人HIF1多抗、兔抗人Bactin多抗和WesternblotLuminolReagent为SantaCruz公司产品。ToplO菌种由本实验室保存。1.2方法1.2.1以pEGFPCl为框架构建shRNA表达载体pWHl(1)用AseI和Mlul双酶切，去掉pEGFPCl质粒上PCMV,EGFP,MCS和SV40polyA等片段，剩余的部分作为构建pWHl的框架。在AseI和MluI之间加上一个接头DNA序列，该段接头DNA由下面2条引物退火形成(退火温度：
7、39.5°C)：序列1：5’TAATGGAATTCGAAGCTTA3'；序列2：5’CGCGTAAGCTTCGAATTCCAT3z□(2)通过PCR从人血细胞基因组DNA获得HlRNA基因Promoter[5]o取新鲜血液20mL,以1300r/min离心15min,取淡黄层细胞(白细胞)重悬于15mL抽提缓冲液(10mmol/LTrisCipH8.0,0.1mmo1/LEDTApH8.0,20mg/L胰RNA酶，5g/LSDS),37°C温育1ho加蛋白酶K至终浓度为100mg/L,温和混匀。5
8、(TC水浴中放置3ho冷却至室温后，用等体积酚和氯仿抽提后，加入0.2体积10mol/L乙酸铁和2体积的乙醇，放置30min,12000r/min离心10mino700mL/L乙醇洗涤2次，空气中晾干。加入1mLTE(pH8.0)溶解DNA,此即人血细胞基因组DNA。以此DNA为模板，PCR引物为：P1：5'CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC3'(含EcoRI位点)；P2：5'GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC3'
