简论shrna表达载体pwh的构建及用于hif基因的沉默的论文

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1、简论shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默的论文简论shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默的论文【摘要】目的:构建用于rnai的shrna（smallhairpinrna）表达载体及检测其对低氧诱导因子1（hypoxiainduciblefactor1,hif1）基因的沉默效果。方法:从人血基因组中pcr扩增出h1基因启动子,克隆入酶切处理后的pegfpc1载体片段中,此载体命名为pwh1。以人hif1cdna基因为靶标设计引物,退火后克隆入pwh1。新的载体

2、转染sgc7901细胞,然后用rtpcr和westernblot检测hif1基因的表达改变。结果:构建的pwh1载体能很好地表达针对hif1基因的shrna,rtpcr和westernblot的结果显示hif1基因的mrna和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shrna表达载体pwh1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。【关键词】shrna表达载体rna干涉hif1基因[abstract]aim:toconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinrna（

3、shrna）andtotestitsefficacyinsilencingthehypoxiainduciblefactor1(hif1)gene.methods:theh1genepromoterwasamplifiedfromthegenomeofthehumanbloodcellsbypcr.thenthepromoterwasclonedintothepegfpc1vectordigestedwiththerestrictionenzyme.theconstructedvectorwasn

4、amedpwh1.theprimerwasdesignedtotargetthehumanhif1cdnagene.theannealedprimerfragmentwasclonedintopwh1.thenewconstructedplasmidwastransfectedintothesgc7901cellline.thentheexpressionlevelofhif1genewasassayedbyrtpcrandwesternblot.results:thenewlyconstructed

5、plasmidexpressedshrnatotargetthehif1gene.theresultsofrtpcrandwesternblotshowedtheexpressionofhif1genewasreduceddramaticalyinmrnaandatproteinlevel.conclusion:thesuccessfulconstructionofshrnaexpressionvector(pwh1)providesatoolforfurtherresearchintothefunc

6、tionofanovelgene.[keywords]shrna;expressionvector;rnainterference;hif1generna干涉(rnainterference,rnai)是将双链rna（dsrna）导入细胞引起特异基因mrna降解的一种细胞反应过程。wwW..COm它是转录后基因沉寂（ptgs）的一种。1998年,fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现,由正义和反义rna退火形成的dsrna引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义rna强10倍以

7、上。dsrna引起的基因表达抑制不是正义或反义rna引起的基因表达抑制在数学上的叠加,这就说明dsrna触发了细胞内的一些反应机制,从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时,他们就把这种现象命名为rnai。rnai的应用谱非常广泛,从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫,其次就是果蝇。哺乳动物细胞的rnai应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。wianny等[2]将dsrna用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了rnai。sayda等[3]用人工合成的21ntrna二合体在培养的哺乳动物细

8、胞成功进行了rnai。brummelkamp等[4]利用载体表达的shrna在许多培养的人源,猴源和鼠源的哺乳动物细胞的rnai实验中取得了成功。在真核细胞内,rna聚合酶iii能指导短rna的表达和rna聚合酶iii结合的启动子有h1,u6等。目前,这两种启动子都被尝试作为表达短rna的工具。本实验旨在克隆得到的h1启动子的基础上构建一个能稳定表达shrna的真核载体。然后针对hif1基因mrna设计靶标,在培养的sgc7901细胞（胃癌