shrna介导的rnai载体构建及对肝癌耐药细胞mdr1基因表达的抑制论文

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1、shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制论文秦维超张有顺周新胡礼仪【摘要】目的：重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体，研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用，以及对P糖蛋白（Pgp）表达和功能的抑制作用.方法：根据MDR1基因序列，设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列（shMDR11，shMDR12），重组构建pshMDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC7721/R，用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素（A

2、DM）的敏感性，流式细胞仪检测细胞膜表面P糖蛋白（Pgp）表达和细胞内Rhdaming123（Rh123）的潴留.结果：PCR和DNA测序证实了pshMDR11和pshMDR12重组质粒的成功构建.freelidgeneratingshorthairpinRNA(shRNA)containingmultidrugresistancegeneMDR1segmentinmammaliancellsandtoinvestigateitssuppressiononMDR1mRNAandPglycoprotein(P

3、gp)expressionsinhepatocellularcarcinomacells.METHODS:BasedonthedesignoftentsofoligonucleotidesforshRNAexpressionids(pshMDR1)easuredbyMTTassay,PgpexpressionandintracellularRh123accumulationinedbyfloetry(FCM).RESULTS:RebinantpshMDR1vectorsedbysequencinganalysis.Th

4、eycouldsuppressPgpexpressioninhepatocellularcarcinomacells.DrugsensitivityulationofRh123entinSMMC7721/Rcells.TheshMDR11oreeffectiveinthesuppressionofMDR1.CONCLUSION:RebinantpshMDR1vectorcansuppresstheexpressionsofMDR1mRNAandPgpinSMMC7721/Rcells.Theinhibitory

5、effectoftheshRNAgeneratedfromtheDNAvectorishighlyrelatedtothetargetsitesandtothedifferentcelllines.【Keyultiple;shorthairpinRNA;rebination,geic;plasmids;geneexpression0引言肿瘤化疗失败的重要原因之一是肿瘤产生多药耐药（multidrugresistance,MDR）.多药耐药基因MDR1基因的过度表达是导致肿瘤细胞产生耐药的重要机制［1-2］.RNA干扰（RNA

6、i）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它通过将双链RNA（dsRNA）导入细胞后，在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA（siRNA），使与该段RNA同源的目的mRNA产生特异性降解，从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象［3-4］.本实验我们运用PGE1载体，构建了含多药耐药基因（MDR1）的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体，观察其对肝癌耐药细胞株SMMC7721/R的MDR1,P糖蛋白（Pgp）表达的抑制作用.1材料和方法1.1材料肝癌细胞株SMMC7721为同济医科大学免疫教研

7、室沈关心教授惠赠，本研究所传代培养.SMMC7721/R细胞由本室用阿霉素对其敏感细胞株诱导成功后冻存.宿主菌大肠埃希氏菌SCS1,PGE1质粒及PGE1阴性对照质粒（shneg）,TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶和MgCl2均购自Promega公司，限制性内切酶BamHI和XbaI购自MBI公司，低熔点琼脂糖购自Gibco公司，小量质粒提取试剂盒和回收质粒纯化试剂盒均购自上海申能博彩公司.转染试剂LyoVecTM为InvivoGen公司产品，抗Pgp抗体为NeoMarkers产品，FITC标记的羊抗鼠Ig

8、G为KPL产品，罗丹明123（Rh123）和四甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma公司产品.1.2方法1.2.1引物的设计针对质粒PGE1序列，利用引物设计软件设计PCR引物序列，ForRNA序列设计MDR1引物1：5′CAGGAGATAGGCTGGTTTGATGGT3′，引物2：5′