介导mdr1的rnai腺病毒载体的构建

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1、介导MDR1的RNAi腺病毒载体的构建【摘要】目的介导MDR1的RNAi腺病毒载体,探讨RNA干扰MDR1基因对人肝癌细胞的作用。方法根据MDR1mRNA序列构建表达MDR1mRNA特异的shRNA的腺病毒穿梭质粒pshuttleMDR1。与腺病毒载体体内重组为pAdMDR1后转染人肝癌细胞SMMC－7721,以FCM检测细胞表面膜蛋白Pgp表达阳性率,以共聚焦显微镜检测细胞内Rh123的潴留,DR1经限制性酶切和PCR证实与设计一致,将pAdMDR1转染肝癌细胞SMMC－7721后,FCM检测细胞表面膜蛋白Pgp表达阳性率为22.9%和30.8

2、%,远低于对照组(85.8%)。MC7721/R的Pgp含量明显低于对照SMMC7721/R，而与SMMC7721/S细胞接近。结论成功构建了pshuttleMDR1腺病毒载体,并有效干扰了肝癌细胞细SMMC－7721MDR1的表达。【关键词】RNAi肝癌细胞多药耐药基因腺病毒载体0引言化疗仍是肝癌综合治疗的重要手段之一，但是肿瘤的多药耐药性成为化疗的障碍。其中MDR1基因及其产物的过度表达是多耐药的重要机制之一［1］。我们应用RNAi技术可在细胞水平明显抑制肝癌细胞SMMC－7721和Bel－7402的MDR1的表达［2，3］。为了进一步提高对

3、细胞的转染效率以及为后期的动物实验做准备。我们设计构建了介导对于MDR1的RNAi的腺病毒载体，并进行了功能实验来验证设计思路的正确和载体构建的成功。1材料与方法1.1质粒质粒PGE1、腺病毒载体pAdeasy－1及穿梭质粒pshuttle均购自Stratagene公司。将针对MDR1的三段siRNA序列重组到PGE1质粒构建的shRNA质粒pshMDR11、pshMDR12、pshMDR13均由本室设计并完成［2，3］。将pshMDR1和pshuttle分别做XhoI和XbaI双酶切并纯化，重组构建成pshuttleMDR1。1．2细菌培养转化及重

4、组质粒的筛选大肠杆菌SCS1、gold10及BJ5183均购自Stratagene公司。常规氯化钙法转化细菌。pAdeasy－1质粒由含氨苄青霉素LB培养基筛选，其他均由含卡那霉素LB培养基筛选。1．3PCR引物设计：选择PshuttleMCS两侧设计PCR引物用作重组质粒的筛选，引物序列为:5’CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG3’和5’GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG3’由上海生工合成。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min。琼脂糖凝胶电泳，未重组Pshuttle质粒

5、为160bp左右产物，而重组质粒在600bp左右。1．4腺病毒载体的构建操作基本照公司操作手册进行，大致如下：重组质粒pshuttleMDR1经PmeI限制性酶切，与腺病毒质粒padeasy共转化BJ5183菌株,鉴定后的阳性克隆经扩增、PacI酶切后,在AD293细胞中包装完整病毒颗粒。1．5细胞培养与转染人耐药肝癌细胞株SMMC7721/R（耐ADM浓度0.2μmol/L）由本室诱导[4]，常规培养于含10%小牛血清，青、链霉素各100U/mlRPMI1640培养基中。LyoVecTM转染试剂为美国InvivoGen公司脂质体产品，按说明书要求进

6、行转染。转染空载体和无关序列载体作阴性对照，以表达荧光素酶基因的载体及shluc基因的表达质粒作为阳性对照组。1.6细胞表面膜蛋白Pgp表达检测各组细胞经消化并调整细胞数为1×106/ml,2%甲醛固定,加入抗Pgp抗体（NeoMarkers公司产品），4℃孵育2h；加FITC标记的羊抗鼠IgGFITC标记的羊抗鼠IgG（美国KPL产品）,室温避光孵育30min，流式细胞仪(Beckmancoulter:EPICXXL)检测细胞表面Pgp阳性率。试验重复3次。TrisHCl(pH7.4)150mMNaCl、5mMEGTA1%TritonX10

7、00.1%SDS)溶解，高速离心取上清，与上样缓冲液1∶1混合，经10%电泳分离，电转移到硝酸纤维薄膜，5%奶粉封闭非特异性位点后，与1∶50抗Pgp抗体温育2h，充分洗涤后与1∶50HRP标记的羊抗鼠IgG（华美生物工程公司产品）温育2h，DAB显色1．7细胞内Rh123的潴留检测调整细胞浓度为1×106/ml，加入Rh123(0.2mg/L)37℃培养箱共孵育45min，冷PBS洗2遍，在0.5h内用流式细胞仪检测细胞内Rh123的强度或者用共聚焦显微镜检测。相同处理组平行5孔，以未经处理的Bel7402/R细胞为空白对照。2结果2．1表达针对MD

8、R1的shRNA和pshuttle的设计及构建pshRNAMDR