抗ToCV RNAi载体构建及转化番茄的研究

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文抗ToCVRNAi载体构建及转化番茄的研究ConstructionofTomatochlorosisvirusResistantRNAiVectorandGeneticTransformationintoTomato研究生姓名王仁汉指导教师王富教授学科专业蔬菜学研究方向蔬菜遗传育种及生物技术中国·青岛二0一八年六月ConstructionofTomatochlorosisvirusResistantRNAiVectorandGeneticTransformationintoTomatoThesissubmit

2、tedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWangRenhan（CollegeofHorticulture）Supervisor:WangFuQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使

3、用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论文摘要抗ToCVRNAi载体构建及转化番茄的研究摘要番茄是一种非常重

4、要的经济作物，其生产状况直接影响着蔬菜产业发展。番茄褪绿病毒是危害番茄的主要病毒之一，该病严重影响番茄的产量和品质，使番茄产业遭受巨大的经济损失。由于传统的病毒防治方法效率较低，不能从根本上解决番茄褪绿病毒，因此，使用分子生物学技术培育抗病品种成为控制番茄褪绿病毒病的最有效途径。基因工程中RNAi技术的快速发展，为番茄褪绿病毒病的防治提供了一个新策略。本研究借助RNAi技术，首先选择ToCVHsp70h基因片段作为RNA干涉区，构建含有Hsp70h基因反向重复序列的干扰载体，并通过农杆菌转化，获得抗ToCV的Micro-Tom转基因植株，并对其抗番茄褪绿

5、病毒能力进行研究。主要结果如下：1.成功构建了抗ToCVRNAi植物表达载体。Hsp70h蛋白参与病毒复制的特殊过程。选择ToCVHsp70h基因的178bp基因片段作为干涉区，根据基因序列设计特异引物Hsp70h正向L/R和Hsp70h反向L/R。在引物5'加入不同的酶切位点，控制正、反目的基因连接载体的方向。将PCR扩增得到的反向目的片段和正向目的片段先后插入到RNAi植物表达载体pFGC5941，构建含有ToCVHsp70h基因反向重复序列的RNAi植物表达载体pFGC5941-H2。通过PCR、酶切、测序验证，均证明抗ToCV的RNAi植物表达载

6、体pFGC5941-H2构建成功，可用于进一步研究。2.通过农杆菌介导番茄遗传转化，获得转基因番茄植株。通过农杆菌介导的植株转化法，将RNAi植物表达载体pFGC5941-H2整合到农杆菌菌株EHA105中，对番茄Micro-Tom叶盘进行遗传转化。经抗生素筛选和脱菌培养获得了抗性芽，进一步进行生根培养后获得了完整的草铵膦抗性植株。经过抗性筛选获得22株阳性苗。对阳性植株进行PCR分子鉴定，检测到其中有4株（A、B、C、D）表现阳性。结果表明目的基因已经整合到番茄Micro-Tom中，获得4株转基因番茄。3.转基因植株攻毒试验，表明ToCVHsp70h基

7、因表达被抑制，转基因番茄植株抗ToCV能力增强。对转基因番茄植株的接种番茄褪绿病毒，沉默Hsp70h基因的番茄植株褪绿症状明显轻于对照植株。在mRNA水平上检测该病毒，ToCVCP的表达量在4株转基因番茄表现出一定差异，C的表达量最低，其次是D、A、B，基因沉默I青岛农业大学硕士学位论文摘要植株毒量低于较对照组，表明Hsp70h基因表达被抑制，RNA干扰ToCVHsp70h基因为抗番茄褪绿病毒的研究提供了技术支持。关键词:番茄；番茄褪绿病毒；干扰载体；转化；基因表达II青岛农业大学硕士学位论文AbstractConstructionofTomatochl

8、orosisvirusResistantRNAiVectorandGenetic