桉树CAD、COMT基因的RNAi载体构建及烟草转化研究.pdf

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1、RNAInterferessionVectorConstructionofEucalyptusCADandCOMTGeneandTobaccoTransgenicResearchZHUQuan—DongAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofSciencelnBiochemistryandMolecularBiologylnCentralSouthUniversityofForestryandTechnology4

2、98ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChangshaHunan410004，P．R．CHINASupervisorAssociateProfessor：ZHANGDang—quanMay，2011中南林业科技大学学位论文原创性声明JIIIrlII)IIiIIlY1913517本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证

3、书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名。矧／伽“年∈只弓。日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：I、保密口，在年解密后适用本授权书。作粼：棚72、不保密笔⋯：～

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5、年f月扣El摘要桉树是我国南方主要造纸树种，但在制浆造纸过程中，桉树木材的木质素去除需消耗大量化学品，并带来严重环境污染。因而，通过转基因技术培育低木质素桉树造纸树种，可从源头上降低木质素含量、减少化学品消耗和降低污染，具有重大的经济效益、社会效益和生态效益。本文以桉树木质素合成调控的2个关键基因：肉桂醇脱氢酶(CAD)和咖啡酸．O．甲基转移酶(COMT)为对象，采用RNA干扰技术，分别构建了桉树CAD、COMT基因的RNA干扰载体pRi．Ec．CAD和pRi．Ec．COMT，并通过烟草转基因实现功

6、能验证，为低木质素桉树转基因育种研究提供理论依据和物质基础。获得了以下主要结果：(1)桉树CAD及COMT基因的RNA干扰片段的获得。在已克隆的桉树CAD、COMT全长eDNA序列的基础上，设计特异引物，通过高保真扩增技术克隆了桉树CAD及COMT的正义、反义基因干扰片段，大小分别为：CAD550bp，COMT616bp。(2)桉树CAD及COMT基因的RNA干扰载体构建。采用现代分子生物学手段，以pRi35s与pCAMBIA2301作为桥梁载体，分别成功构建了含有CaMV35S启动子、过氧化氢酶内含子(eatalasein

7、tron)及具有抗生素(Kan)选择标记基因的CAD及COMT基因的RNAi载体：pRi．Ec．CAD和pRi．Ec．COMT，并通过冻融法将其成功导入农杆菌LBA4404中。(3)桉树CAD及COMT基因的RNA干扰载体的烟草转基因。通过农杆菌介导的叶盘法转化技术，将RNAi载体pRi．Ee．CAD和pRi．Ec．COMT分别转入到模式植物烟草中，并获得了经抗Kan筛选的RNAi片段的候选转基因植株，对候选植株的基因组DNA进行卡那霉素基因扩增检测，筛选出桉树CAD及COMT基因RNA干扰载体导入的阳性转基因烟草植株。(4

8、)桉树CAD基因的RNA干扰效果分析。对不同时期生长的转桉树CAD基因干扰片段的烟草植株进行表型观察，与野生型烟草植株相比，转基因烟草植株的形态和生长发育未见异常；对培养了6个月的转基因植株进行Klason木质素分析，与野生型烟草植株相比，转基因烟草植株木质素含量降低了12．3％'---14．5％，表明桉树CAD基因的RNA干扰载体在不影响烟草植株正常生长发育情况下，能有效降低烟草植株的木质素含量。(5)桉树COMT基因的RNA干扰效果分析。对不同时期生长的转桉树COMT基因干扰片段的烟草植株进行表型观察，与野生型烟草植株相

9、比，转基因烟草植株在整个生长时期都表现出较大差异，叶片较大，植株矮小，茎段柔软细小，易倒伏，生长缓慢且成活率低；对培养了6个月的转基因烟草植株进行Klason木质素分析，与野生型烟草植株相比，转基因烟草植株木质素含量分别降低2．4％～3．0％，结果表明，桉树COMT基因的RNA干扰载体对烟